3.2.2 Видовая идентификация Cryptococcus neoformans

Видовую идентификацию штаммов C.neoformans проводили масс- спектрометрическим анализом на приборе MALDI-TOF MS Biotyper Autoflex (Bruker, Германия). Идентификация в MALDI Biotyper происходит в основном по рибосомальным белкам, которые являются уникальными для всех микроорганизмов.

Предварительно штаммы культивировали на 4% сусло-агаре («НИЦФ», Россия) при 35° С в течение 48 часов. Для последующего исследования белкового профиля культуры проводили прямое нанесение ее на 2 позиции мишени масс- спектрометра с последующей обработкой 1 мкл 70% раствором муравьиной

кислоты, параллельно из культур готовили белковые экстракты. В деионизованной воде готовили густую суспензию культур C. neoformans, которую затем отмывали от компонентов среды путем центрифугирования при 15000 g в течение 2 мин. Полученный осадок клеток ресуспендировали в 0,9 мл абсолютного этанола, взбалтывали на вортексе («Biosan», Латвия) и выдерживали при комнатной температуре 30 мин. Затем этанол удаляли повторным центрифугированием (15000 g, 2 мин). Осадок клеток обрабатывали с помощью

20 мкл 70% раствора муравьиной кислоты, перемешивали на вортексе, затем добавляли 20 мкл гиперградиентного ацетонитрила для ВЭЖХ и перемешивали пипетированием. Клетки осаждали центрифугированием при 25000 g 2 минуты, а надосадочную жидкость (белковый экстракт) в объеме 2 мкл использовали в работе. На обработанную кислотой культуру и высохший белковый экстракт на мишени наносили 1 мкл раствора матрицы, состоящей из свежеприготовленного насыщенного при комнатной температуре раствора α-циано-4- гидроксициннамовой кислоты в смеси гиперградиентного ацетонитрила (50%), деионизованной воды (47,5%) и трифторуксусной кислоты (2,5%). Образцы высушивали под вытяжкой, затем мишень загружали в вакуумный шлюз масс- спектрометра [13, 49].

Идентификацию проводили с использованием программного обеспечения MALDI Biotyper RTC 3.1 (Bruker Daltonics, Германия) путем сравнения полученных результатов с базой референтных спектров II.2014. При видовой идентификации придерживались следующих критериев показателей, рекомендованных производителем: < 1,7 – идентификация не возможна; 1,7-1,99 – вероятная родовая идентификация; 2,0-2,29 – точная идентификация рода, вероятная видовая идентификация; >2,3 – видовая идентификация с высокой вероятностью [187].

Процедуру идентификации проводили повторно до достижения максимального значения показателя достоверности.

Работа по определению вида C. neoformans методом масс-спектрометрии выполнена при непосредственном участии сотрудников НИИ медицинской микологии им. П.Н.Кашкина СЗГМУ им. И.И.Мечникова И.А. Рябинина и Е.Р.

Рауш.

Ранее в лаборатории молекулярной микологии Центра инфекционных заболеваний и микробиологии (Австралия, г. Сидней), методами ПЦР-отпечатков с праймером М13 и RFLP (Restriction Fragment Length Poiymorphism) гена URA5 с использованием рестриктаз Hhal и Sau96 была пароведена идентификация использованных в исследовании штаммов C. neoformans РКПГ Y 1164, Y 1165 и Y

1175 [5].