Методы идентификации нуклеиновых кислот

В диагностике бактериальных и вирусных инфекций, прото- зойных инвазий в настоящее время широко применяют: а) методы гибридизации нуклеиновых кислот (НК), в основе которых лежит их способность соединяться с комплементарными нитями (фрагментами); б) полимеразную цепную реакцию (ПЦР) наращивания копий определенного фрагмента ДНК в реакции, катализируемой ДНК-полимеразой.

Метод гибридизации НК. Основной алгоритм ДНК- идентификации микробов состоит в следующем. ДНК, выделенную из прокариот, эукариот и вирусов, культивируемых вне организма, подвергают расщеплению рестрикционной эндонуклеазой. Среди множества образовавшихся ее фрагментов необходимо найти один или несколько, несущих определенную нуклеотидную последовательность, чтобы охарактеризовать ДНК. Для этого разделенные электрофорезом в геле фрагменты ДНК «перепечатывают» на фильтр (нитроцеллюлозу или нейлон), фиксируют на нем и подвергают гибридизации с так называемым «зондом» - олигонуклеотидом, меченным радиоизотопом. Этот зонд представляет собой ранее клонированную с помощью методов генетической инженерии нуклеотидную последовательность гена, подлежащего исследованию, или нуклеотидную последовательность, синтезированную искусственным путем.

Благодаря тому что нуклеотидная последовательность зонда специфически связывается с комплементарными последовательностями фрагмента, зафиксированного на фильтре, указанный фрагмент выявляется путем экспозиции с рентгеновской пленкой.

Подобный процесс гибридизации может происходить между двумя любыми одинарными цепями НК(ДНК:ДНК, РНК:РНК, ДНК:РНК).

Точность такого теста настолько велика, что с его помощью можно выявить комплементарные ДНК-зонду нуклеотидные последовательности даже в тех случаях, когда концентрация их составляет всего лишь одну молекулу на клетку.

Полимеразная цепная реакция. При постановке ПЦР двунитчатая ДНК разделяется на отдельные цепочки термическим путем. Для ее запуска в среду вносят синтетические олигонуклеотиды-праймеры (затравки), состоящие из 10-20 нуклеотидов, способных взаимодействовать с окончаниями нуклеотидных последовательностей обеих цепочек, термостабильную taq- полимеразу, полученную из бактерии Thermus aquaticus, и свободные дезоксинуклеотидтрифосфаты, которые полимераза последовательно присоединяет к затравкам. Полученные ДНК снова разделяют на отдельные цепочки и всю процедуру наработки новых копий повторяют, однако без введения taq-полимеразы, поскольку в ПЦР она не затрачивается и, будучи термоустойчивой, не разрушается. С помощью ПЦР из одной молекулы ДНК можно получить миллионы ее копий, идентификацию которых осуществляют методом электрофореза.