Методы идентификации CpG-островков, аберрантно-метилированных в опухолях.
MCA (methylated CpG island amplification) - метод, позволяющий избирательно амплифицировать CpG-островки, дифференциально метилированные в нормальных и опухолевых клетках, а затем клонировать и секвенировать их (Toyota et al.
1999). ДНК вначале обрабатывают рестриктазой Smal (сайт узнавания СССGGG не расщепляется, если он содержит 5-метилцитозин), которая дает фрагменты с "тупыми" концами. Метилированные сайты СССGGG затем расщепляют нечувствительной к метилированию рестриктазой Хит!, которая формирует фрагменты с "липкими" концами. Именно последние могут взаимодействовать с адаптерами и быть в последующем амплифицированны. В сочетании с методом репрезентативного дифференциального анализа (RDA) (Lisitsyn et al. 1993) этот подход позволяет избирательно амплифицировать CpG-островки, аберрантно метилированные в опухолевых клетках. Таким способом в клетках рака толстого кишечника были идентифицированы и клонированы 33 последовательности, включая фрагменты известных генов (PAX6, Versican, a-tubulin, CSX, OPT и др.).RLGS (restriction landmark genomic scanning) позволяет одновременно анализировать статус метилирования в геноме нескольких тысяч CpG-островков (Eng et al. 2000; Costello et al. 2000). Суть метода заключается в разделении двухмерным электрофорезом рестрикционных фрагментов, полученных обработкой геномной ДНК несколькими рестриктазами. Вначале ДНК обрабатывают крупнощепящей рестриктазой NotI, сайты которой предпочтительно располагаются в CpG-островках и которая расщепляет только неметилированные сайты. Затем полученные фрагменты метят по концам радиоактивной меткой, рестрицируют вторым ферментом (например, EcoRV) для уменьшения их размеров и продукты гидролиза разделяют в первом направлении (в капиллярной трубке с агарозным гелем). Разделенные фрагменты Notl/EcoRV обрабатывают in situ (т.е. в геле) еще одной рестриктазой (например, HinfI) для большей фрагментации ДНК, после чего проводят электрофорез в полиакриламидном геле во втором направлении.
Пластину геля авторадиографируют и в результате выявляют множество пятен, положение которых строго определено. По их интенсивности судят о степени метилирования соответствующего CpG-островка. Интенсивность пятна, принятая за нормальную, свидетельствует о неметилированном статусе обоих аллелей, наполовину сниженная - о метилировании одного из аллелей, исчезновение пятна - о метилировании обеих аллелей (соответствующий сайт не расщепляется NotI). Именно этим методом было продемонстрировано широкое распространение аберрантного метилирования CpG-островков во многих типах опухолей.СП-ПЦР (метилчувствительная ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами) используется для поиска CpG-островков, абберантно-метилированных в опухолях (Gonzalgo et al. 1997; Liang et al. 1998). Достоинством метода является возможность выявления ранее неизвестных CpG-островков. Метод основан на использовании статистических праймеров с GC-богатым 3' концом, амплифицирующих в неспецифических условиях GC-богатые участки генома, включая и CpG-островки. Различие в статусе метилирования фрагментов выявляют с помощью предшествующей амплификации обработки ДНК метилчувствительными рестриктазами. При использовании различных вариантов праймеров этот метод позволяет вести широкий скрининг дифференциально метилированных в нормальной и опухолевой тканях GC-богатых последовательностей (подробнее о принципе метода см. в разделе "Результаты").
Еще по теме Методы идентификации CpG-островков, аберрантно-метилированных в опухолях.:
- 1. Поиск CpG-островков, гиперметилированных в опухолях шейки матки
- 14.2. Критерии CpG-островков.
- 2.2. Изучение статуса метилирования CpG-островка гена /ЗА-адаптина в опухолях шейки матки и в клеточных линиях рака шейки матки.
- 1.4. Определение полного размера CpG-островка гена /ЗА-адаптина.
- 1.З. Определение статуса метилирования CpG-островка З2 при раке шейки матки.
- 8.7.4.1 Опухоли из аберрантной щитовидной железы
- Методы анализа статуса метилирования CpG динуклеотидов.
- Методы идентификации нуклеиновых кислот
- 2.3 Идентификация Candida spp. методом ДНК-секвенирования
- 2.4 Идентификация Candida spp. методом MALDI-TOF масс- спектрометрии
- 3.2 Сравнение результатов видовой идентификации Candida spp. методами ДНК-секвенирования и MALDI-TOF масс-спектрометрии