2.3 Идентификация Candida spp. методом ДНК-секвенирования

Выделение ДНК микромицетов

Для выделения ДНК использовали двухдневные культуры Candida spp. Выделение ДНК производили по модифицированому методу Doyle и Doyle [59]. Разрушение клеточной стенки гриба проводили с помощью гомогенизатора Precellys со стеклянными шариками 5 мм (Sigma, США).

ТЕ. Концентрацию выделенной ДНК измеряли на флуориметре Qubit

(Invitrogen, США).

Молекулярно-генетический анализ

Молекулярно-генетическая идентификация с помощью секвенирования ДНК проводилась согласно рекомендациям СLSI ММ18-А [49]. Идентификация основывалась на определении нуклеотидной последовательности регионов нетранскрибируемого межгенного спейсера ITS1 и ITS2, и фрагмента D1/D2 гена, кодирующего большую рибосомальную субъединицу 28S рРНК, с использованием праймеров ITS4 и ITS5, и NL1 и NL4, для намножения соответствующих фрагментов генов ITS и D1/D2 [27], структура праймеров приведена в таблице 4. Полученные фрагменты разделяли с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле в трис-борат-ЭДТА буфере в присутствии бромистого этидия и визуализировали в УФ-свете. ПЦР- продукты очищали с помощью набора для очистки ДНК «Омникс» (Омникс, Санкт-Петербург).

Таблица 4 – Структура праймеров, используемых для идентификации микромицетов

Секвенирование ДНК выполнялось по методу Сэнджера на генетическом анализаторе ABI Prizm 3500 (Applied Biosystems, США). Реакцию проводили с использованием набора BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) в объеме 10 мкл согласно рекомендациям производителя.

несоответствия между фенотипической и молекулярно-генетической идентификациями были проверены повторным секвенированием. Подготовку последовательности и секвенирование образцов осуществляли по стандартным протоколам, как описано ранее [6, 49]. Последовательности прочитывали с обеих нитей ДНК, после удаления структур праймеров. Затем проводили сравнение полученных последовательностей с последовательностями, депонированными в базе данных GenBank и базе данных Центра биоразнообразия грибов при Центральном бюро грибных культур (Нидерланды). Поиск в базе данных GenBank осуществляли по алгоритму megablast. Размер слова был 28 нуклеотидов для GenBank и 20 на CBS, параметры по умолчанию. В анализ были взяты 414 нуклеотидов, кодирующих фрагмент транскрибируемого спейсера ITS1, ген 5,8S рибосомной РНК и фрагмент спейсера ITS2 и 416 нуклеотидов, кодирующие регион D1/D2 гена 28S pPНК [6, 27, 49, 59, 60, 121].

Данный метод видовой идентификации возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза проводили в НИЛ молекулярно- генетической микробиологии НИИ медицинской микологии им. П. Н. Кашкина (зав. лабораторией Тараскина А. Е.).