9.0.2. Секвенирование

Последовательность аминокислот в молекуле фермента ред­ко удается установить полностью с помощью рентгеноструктур­ного анализа. Быстрее и точнее это можно сделать путем сек-

Рис.

венирования. Хотя оно и не позволяет получить информацию непосредственно об активных центрах ферментов, тем не менее это удается в тех случаях, когда реагент может образовывать ковалентную связь с одной из групп активного центра. В каче­стве субстратов для изучения протеолитических ферментов час­то используют органические фосфаты (разд. 13.3). Так, диизо- пропилфторфосфат (13.26) взаимодействует с химотрипсином как псевдосубстрат и, фосфорилируя активный центр, делает невозможной реакцию с истинным субстратом. Было установле­но, что в каждой молекуле фермента одна молекула ингибитора взаимодействует с одним активным центром. В результате гидролитического расщепления фермента, обработанного диизо- пропилфторфосфатом, образуется диизопропилфосфосерин. Это позволяет сделать вывод о том, что остаток серина играет важ­ную роль в активном центре данного фермента [Shaffer, May, Summerson, 1954]. Подобный анализ продуктов расщепления показал, что в активных центрах химотрипсина (каждая его молекула содержит 230 аминокислот, 28 из которых являются остатками серина) и трипсина расположена последовательность Asp — Ser — Gly, в то время как в активных центрах АХЭ псевдохолинэстеразы и алиэстеразы печени присутствует после­довательность Glu — Ser — Ala [Sanger, 1963].

Дополнительную информацию об активных центрах фермен­тов получают с помощью молекулярных зондов (разд. 2.4). 9.0.3. Кинетика ферментативных реакций

Жизненно важная роль ферментов в метаболизме заключа­ется в том, что они ускоряют бесчисленное множество химиче­ских реакций, протекающих в клетке. Ферменты снижают энер­гетический барьер и тем самым повышают скорость протекания реакции. Например, с помощью фермента каталазы энергия активации реакции разложения перекиси водорода (Н2О2 —► —> Н2О + О) снижается с 18 до 2 ккал/моль, а скорость реак­ции увеличивается в 1,6Х 10^й раза.

Высокая каталитическая активность ферментов основана на общих принципах физической и органической химии: а) моле­кула субстрата взаимодействует с ферментом с изменением конформации одного из них или обоих, при этом образуется переходное состояние, более энергетически выгодное по срав­нению с субстратом; б) затем фермент может инициировать раз­рыв ковалентной связи вследствие близости реагирующих групп; в) этому способствует электрическое поле, поддерживающееся в очень малом объеме в необычно безводной среде, т. е. с низ­кой диэлектрической постоянной и г) боковые цепи аминокис­лотных остатков, расположенные в полости вокруг активного центра, могут образовывать короткоживущие связи, способст­вующие протеканию реакции. В бимолекулярных реакциях на ферменте создается значительно более высокая концентрация субстратов, чем в растворе, при этом они находятся ближе друг к другу и лучше ориентированы. Ферменты обладают двумя типами специфичности: I) разной степенью сродства к субстра­там и 2) разной скоростью реакции для различных субстратов после связывания. Эти типы называются специфичностью свя­зывания и кинетической специфичностью и проявляются незави­симо друг от друга [Koshland, Neet, 1968].

Первым выделенным комплексом субстрата с ферментом был комплекс D-аланин, оксидаза D-аминокислоты и кофактор ФАД (флавинадениндинуклеотид). Этот комплекс представляет собой гексагональные кристаллы пурпурного цвета, стабильные в отсутствие воздуха. Исследования методом ЭПР показали, что в этих кристаллах кофактор присутствует в свободноради­кальной моногидроформе FADH [Yagi, 1965].