Условия культивирования продуцентов тилозина

Динамика накопления в культуральной жидкости антибиотика тилозина имеет типичный вид зависимости, характерный для биосинтеза вторичных метаболитов, т.е. максимум образования би­омассы предшествует максимуму антибиотикообразования (рис.

Рис. 4. Динамика накопления тилозина (1) и изменение концентрации влажного осадка (2) в процессе культивирования штаммов Str. fradiae 25 А (а) и Str. fradiae 165 (б) в лабораторных ферментерах объемом 1.7 л

В качестве источника азотного питания для комплексных сред может быть использована рыбная и мясная мука, мясной экстракт, смесь аминокислот, дрожжи, казеин, кукурузный эк­стракт; в качестве источника углерода — глюкоза, меласса, крахмал. В среде обычно присут­ствуют в небольших количествах соли, содержащие натрий, магний, алюминий, кальций, ко­бальт в виде сульфатов, фосфатов и хлоридов. Высокие концентрации ионов железа оказывают угнетающее действие на биосинтез тилозина. Оптимальная концентрация железа в среде 5-10 мкг/мл.

Для культивирования продуцента тилозина обычно используется ферментационная среда сле­дующего состава; рыбная мука —2,0; меласса (по РВ) — 2,0; крахмал — 1,5; (NH₄)₂HPO₄ — 0,02; NaCl — 0,2; MgSO₄ • 7Н2О — 0,2; СаСО₃ — 0,5; соевое масло — 3,0; pH среды до стерилизации 7,0-7,5.

Отмечается, что существенное влияние на биосинтез тилозина оказывает pH среды, его опти­мальное значение, согласно данным литературы, составляет 6,5-7,0 или 7,4-7,6. К концу фермен­тации величина pH достигает для штамма Str. fradiae 25А — 7,5-7,8, для менее активных штам­мов 8,0-8,3. Защелачивание культуральной жидкости, как правило, сопровождается лизисом культуры и падением концентрации антибиотика. Увеличение количества масла в среде, напри­мер, путем его дробного внесения и поддержания на заданном уровне, приводит к стабилизации уровня накопления тилозина, а также максимального уровня накопления биомассы и значения pH среды.

Культура лучше растет при температуре 25—32 °С, а синтезирует — при 26—30 °С. Для штамма Str. fradiae 165 показано, что увеличение температуры культивирования до 35 °С сопровождается увеличением количества образовавшейся биомассы и резким снижением антибиотической актив­ности. В основном, на протяжении всего процесса поддерживают температуру 28—30 °С, но в лите­ратуре есть данные о преимуществе ферментаций, во время которых в первые 10 часов фермента­ции температуру увеличивали до 37 °С.

Процесс культивирования осуществляют при постоянном перемешивании, расходе воздуха 1 об./об. • мин. Синтез тилозина заканчивается на 6—9-е сутки.

Рекомендуется проводить процесс ферментации в колбах объемом 300 и 750 мл на качалках с числом оборотов 220-300 об./мин и в аппаратах объемом 1,7 л, 630 л, 63 м³ с объемами среды 1,

1 л, 300 л, 30 м³ соответственно, при следующих условиях: доза засева, как правило, 2,5-10 %, температура культивирования — 28 °С, расход воздуха — 0,5-1,5 об./об. • мин, число оборотов ме­шалки — 550-650 об./мин для аппаратов объемом 1,7 л и 150-170 об./мин для ферментеров объ­емом 630 л и 63 м³.

Для достижения высокого выхода тилозина необходимо обеспечить в ферментере высокую кон­центрацию растворенного кислорода, максимальное потребление кислорода наблюдается в начале ферментации. Есть данные, что динамика изменения концентрации растворенного кислорода в культуральной жидкости продуцента тилозина существенно зависит от изменения ее реологичес­ких свойств.

Как показано в работе, максимальная скорость синтеза тилозина, достигаемая на 3-4-е сутки ферментации при периодическом культивировании продуцентов, существенно зависит от интен­сивности аэрации культуральной жидкости и для штаммов Str. fradiae 25А и Str. fradiae БС-1 может быть доведена до 1,5-2,0 г/л ■ сутки. Оценка интенсивности аэрации культуральной жидкости в ферментере может вестись по,количеству СО₂ в отводимом из ферментера воздухе.

Важно, однако, отметить, что при увеличении интенсивности аэрации культуральной жидкос­ти концентрация тилозина в конце ферментации и максимальная скорость его синтеза стремятся к некоторому пределу, характерному для данного штамма-продуцента и выбранного состава пита­тельной среды. В рассматриваемом случае предельное значение концентрации тилозина в конце ферментации равно 8 г/л, а максимальное значение скорости синтеза тилозина 2,0 г/л • сутки (рис. 6).

Рис. 5. Зависимость от времени интенсивности образования СО2 (I), изменения концентрации тилозина (2) и влажного осадка (3) в культуральной жидкости в процессе культивирования штамма Str. fradiae БС-1 в лабораторных

ферментерах объемом 1,7 л. Расход воздуха 1,0 об/об • мин, число оборотов мешалки < 600 об/мин

С целью интенсификации процесса биосинтеза тилозина и других антибиотиков предложено разбавление культуральной жидкости в процессе ферментации водой.

Имеются указания на то, что выход тилозина может быть увеличен при добавлении в среду фос­форнокислого магния, пропилового спирта, фумаровой кислоты, бромида аммония, конденсатов формальдегида. Показано, что влияние циклического АМФ на процесс биосинтеза тилозина зави­сит от состава среды и физиологического состояния культуры.

На примере тилозина в условиях хемостата отчетливо показан эффект репрессирования синте­за антибиотика глюкозой.

В некоторых работах указывается, что иногда азотная репрессия у штамма Str. fradiae не сход­на с углеродной репрессией. Например, значение скорости синтеза тилозина возрастает с увеличе­нием в среде концентрации глутамата натрия. Увеличение удельной скорости поглощения глута­мата натрия может стимулировать синтез тилозина путем увеличения количества предшественни­ков, необходимых для синтеза лактонового кольца; На основании полученных данных была разра­ботана среда с низким содержанием глюкозы и повышенным содержанием глутамата натрия. За­висимость начала синтеза тилозина от перехода культуры в идиофазу на этой среде отсутствует, ан­тибиотик образуется в момент быстрого роста культуры.

Проводились работы по созданию отечественных продуцентов тилозина, в частности, Str. fradiae 25В (ВКПМ-S 1112), устойчивых к катаболитной репрессии и ингибированию неорганическим фосфором.

Кроме тилозина штамм Str. fradiae способен образовывать тилозиноподобные вещества (макро- цин, десмикозин, реломицин, лактеномицин). Предложены методики определения состава этого антибиотического комплекса. Имеются сведения о том, что макроцин является непосредственным предшественником тилозина, лактеномицин и десмикозин могут образовываться на различных стадиях превращения тилактона. Реломицин, появляющийся в конце процесса ферментации, яв­ляется продуктом восстановления тилозина.

Подробно изучены генетические и биохимические аспекты механизма образования тилозина и родственных ему соединений, принимающих участие в этом процессе.

.Рис. в. Зависимость от конечной концентрации (1) и максимальной скорости синтеа (2) тилозина в культуральной жидкости от интенсивности аэрации при культивировании штамма Str. fradiae БС-1 в колбах объемом 300 мл. Продолжительность ферментации — 7 суток

нечного этапа биосинтеза тилозина. Проведены работы по установлению локализации генов, от­ветственных за процесс биосинтеза тилозина. Авторами работы выделен соответствующий фраг­мент ДНК.

Изучено влияние ионов аммония, неорганического фосфата и аминокислот на процесс биосин­теза тилозина. При увеличении уровня фосфата наблюдается уменьшение скорости синтеза тило­зина.

Увеличение степени поглощения фосфора уменьшает количество образовавшегося тилозина и увеличивает количество реломицина. В процессе периодического культивирования наблюдается трехкомпонентная система (тилозин, реломицин и макроцин), а в ферментациях, проведенных в хемостате, — двухкомпонентная (тилозин и реломицин).

Изучен процесс биосинтеза тилозина в условиях культивирования на синтетической среде с подпиткой. С целью поддержания скорости синтеза тилозина на высоком уровне были использо­ваны три скорости долива среды. При оптимальной скорости подпитки общий объем синтезиру­емого антибиотика превысил контрольный, что происходило не за счет увеличения удельной ско­рости биосинтеза, а за счет дополнительного (по сравнению с контрольным) прироста биомассы.

С помощью циклических подпитывающих добавок возможна стимуляция активности фермен­тов, участвующих в биосинтезе тилозина, и увеличение периода активного синтеза этого антиби­отика на синтетической среде.

Подобран количественный состав основных питательных компонентов комплексной фермента­ционной среды, вносимых в начале и по ходу процесса культивирования продуцентов тилозина, исключающий снижение концентрации антибиотика к концу ферментации и позволяющий, при необходимости, продлить период активного синтеза до 10—12 суток.

Для продуцента тилозина Str. fradiae показано, что ряд аминокислот в свободном или свя­занном (в пептидах и белках) виде может служить альтернативным источником ацетил-КоА. Так, например, L-треонин служит источником коферментов, необходимых для биосинтеза ти­лозина и жирных кислот. Валин также является источником предшественников жирных кис­лот для биосинтеза макролидов, мощным индуктором синтеза валиндегидрогеназы в мицелии Str.fradiae.

Рис. 7. Принципиальная технологическая схема производства тилозина для стадий подготовки посевного материала и культивирования штаммов-продуцентов Str. fradiae. 1 — чашки Петри с колониями штамма-продуцента, 2 — пробирки и матрасы с вегетативной культурой, 3 — качалка с колбами для проверки активности колоний и размножения посевного материала, 4,5,6,7 — сборники компонентов питательной среды и титрующих растворов, 8,9 — смесители для приготовления сред,

10,11 — сборник и стерилизатор воды, 12, 29, 31 — мерники, 13, 33 — насосы, 14 — нагреватель-стерилизатор, 15 — выдерживателъ, 16 — теплообменник-охладитель, 17 — инокулятор, 18 — головной фильтр, 19, 23, 27 — индивидуальные фильтры очистки воздуха, 21, 25, 32 — фильтры очистки отработавшего воздуха,

20, 24, 28 — сборники пеногасителя, 22 — посевной аппарат, 26 — ферментер. 30 — стерилизатор масла

6.