Микроводоросли как первые продуценты дейтерированных соединений

Микроводоросли были одним из модельных организмов для определения ИЗОТОПНОГО Э() дейтерия тяжелой воды с самого начала такого рода экспериментов еще в середине 1930-х гг. ственно позже стали рассматривать микроводоросли как источник индивидуальных д< соединения, выделяемых из дейтерированной биомассы.

Даже на частично дейтерированной среде у культур Chlorella обнаруживалось подавленье синтеза, но при этом возрастала способность накапливать аминокислоты и интермедиаты ре­цикла Кребса. Продолжение изучения фотосинтеза позволило установить, что растущие де; рованные клетки теряют 10-30 % способности фиксировать ¹⁴СО₂, обнаруживают ингибирс темновых фотосинтетических реакций. В результате этих ранних исследований встал воп. что следует считать причиной подавления процессов жизнедеятельности микроводорослей ственно изотопный эффект дейтерия D2O или эффект от действия на клетки дейтериров, метаболитов?

Эту дилемму удалось разрешить японским ученым из Университета Шизуока на следующе пе изучения действия тяжелой воды на культуры Chlorella. Для этого сравнили уровни биоси; ческих процессов дейтерированных клеток, .частично дейтерированных клеток и обычных к в средах из природной или тяжелой воды. Оказалось, что фиксацию СО₂ ингибирует именно . рий Б₂О-среды. Установили также, что у дейтеро-клеток равновесие между синтезом сах (в цитоплазме) и крахмала (в хлоропластах) сдвинуто в сторону последнего, в отличие от пре рованных клеток. Позже показали, что причиной «сверхсинтеза» дейтеро-крахмала являете кое снижение активности амилолитических ферментов в дейтерированных клетках С. ellipsoid

В целом, развитие исследований микроводорослей как объекта массового культивиро привело к появлению представления, что их (микроводоросли) можно рассматривать как а.

Параллельно этим исследованиям в нескольких странах шла разработка методов культивн ния микроводорослей на средах из тяжелой воды для получения дейтерированных ВАВ. Об при росте на О₂О-среде культуры С. ellipsoidea обнаруживают пятикратное увеличение ept генерации (до 223 ± 6 ч от обычных 40 ± 2 ч на Н₂О) и увеличение объема клеток в 2,3 раза. 1 изменения объясняются существенным снижением в дейтеро-клетках АТФ, хлорофиллов, ка ноидов, белков и липидов. При этом относительный уровень ДНК и РНК одинаков. Российск; следователи разработали высокопродуктивную установку с плоскими прозрачными камерам нащенными системой циркуляции культуральной жидкости по замкнутому контуру и аэрирс смесью СО₂ + N₂, обедненной по кислороду. Наилучшие результаты получали при культивн нии в ступенчато-накопительном («отливно-доливном») режиме, обеспечивающем проду ность до 7 г сухой биомассы (5 • 10⁸кл./мл) сіл В₂О-среды за 5 суток.

Как уже отмечалось выше, дейтерированные БАВ, синтезируемые микроводорослями, на: ли применение в различных исследованиях в качестве изотопно меченных зондов. Позже ста. пользовать низкомолекулярные фракции гидролизатов биомассы микроводоросли С. ellips< выросшей на тяжеловодной ростовой среде с добавлением радиоактивного NaH¹⁴CO₃. Из такої массы выделяли фракции аминокислот, фосфорилированных сахаров и смеси глюкоза+галак Двойная метка (D+¹⁴C) оказалась удобной для изучения поведения биомолекул при их ввел в кровь мышей в ходе исследования распределения соответствующих соединений в разли тканях. Эти исследования продолжили разработку методов получения радиофармацевтиче препаратов, использумых при исследованиях мозга.

Еще один вид микроводорослей — Spirulina maxima — довольно хорошо растет на высок- терированных средах. Эта особенность определила интерес к химическому составу биол

149

S. maxima, в частности, к липидному составу. При изучении методами ЯМР и МС с использовани­ем бомбардировки быстрыми атомами, а также обычными химическими методами было установ­лено, что биомасса, продейтерированная на 97,5 % , содержит те же основные липиды, что и недей- терированные клетки: 9 % неполярных, 5 % моногалактозилдиацетилглицерина, 22 % дигалакто- зилдиацилглицерина, 31 % фосфатидилглицерина, 32 % сульфоквиновазилдиацилглицерина и следовые количества фосфатидилинозитола. Основные жирные кислоты составляли 16:0 (80 %) и 18 : 1 (15 %). Выделяемые дейтеро-липиды могут быть использованы для конструирования искусственных высокодейтерированных мембран известного состава, а также для приготовления из них липосом,-используемых в различных исследованиях.

Таким образом, и сегодня микроводоросли как источник дейтерированных БАВ находят при­менение в научной и практической сферах. Вместе с тем низкая скорость роста и низкий выход биомассы на тяжеловодных средах, сравнительно узкий круг синтезируемых соединений и нераз­работанность систем экспрессии дополнительных генов делают очевидными необходимость поиска более удобных продуцентов стабильно меченных БАВ.

Масштабного производства каких-либо дейтерированных соединений с помощью микроорга­низмов в мировой практике нет. Вместе с тем есть много работ, позволяющих ожидать появление такого рода сообщений. Так, еще в 1988 г. была предложена биотехнологическая схема получения дейтеро-липидов. Интересно отметить, что водоросль-продуцент Neochloris sp. при росте на D₂O синтезировала гораздо больше целевого липида, чем на простой воде. Использование же дейтеро- липидов в смазочных составах помогает преодолевать термическое разрушение благодаря их боль­шей термостойкости по сравнению с протонированными липидами.

Микроводоросли, адаптированные к тяжелой воде, способны продуцировать большое число разнообразных дейтерированных соединений.

Биотехнологический способ не вызывает затруднений и потому широко применяется для получе­ния ¹³С-, ¹⁵N-, ¹⁸О-меченных, а также множественно изотопно меченных биологически активных соединений. Чаще всего для биосинтеза ¹³С-, ¹⁵N-, ¹⁸О-меченных аналогов используют генетически сконструированные штаммы-продуценты соответствующих соединений. При этом продуцентам, соз­данным на базе штаммов E.coli, просто заменяют источник азота ¹⁵NH4C1 или глюкозу гидролизатом ¹⁸О-, ¹³С-биомассы микроводорослей. Для униформного введения метки ¹³С часто используют в качест­ве источника углерода ¹³С-ацетат, ¹³С-глюкозу или ¹³СО₂. Для введения метки ¹⁸О, как и в случае с дей­терием, необходимо использовать одновременно и ¹⁸О-воду, и гидролизат ¹⁸О-биомассы. Все варианты перечисленных замен обычно не вызывают никаких изменений в культурах-продуцентах, соответст­венно, упрощая получение униформно ¹⁸О-, ¹⁵N- или ¹³С-меченных БАВ, включая сложные белки.

7.2.