Физико-химические и биологические свойства культуральной жидкости. Исследование физиологии продуцента дендробациллина

Без исследования наиболее важных для роста и развития энтомопатогенных бактерий показате­лей физиологии невозможно дальнейшее изучение технологических процессов. Поэтому далее бы­ли изучены показатели: степень и скорость потребления глюкозы, образование экзопротеаз, дли­тельность фаз роста, изменение величины pH, ЛК50, титра вегетативных клеток и спор при разви­тии культуры.

Изучение этих показателей проводили в условиях культивирования продуцента дендробацил- лина в ферментере «New brunswick» объемом 7 л при различном уровне массообмена кислорода, выраженном величиной K_La, от 12 до 400 ч^-1.

Процесс роста был разделен на 5 условных фаз, включающих основные стадии развития куль­туры: лаг-фазу и начало вегетативного роста, экспоненциальную фазу (собственно размножение вегетативных клеток), «гранулез», начало спорообразования, спорообразование до появления еди­ничных свободных спор в культуральной жидкости, массовое «высыпание» спор, т.е. освобожде­ние их из клетки.

Установлено, что изменение величины К_1-а в столь широком диапазоне незначительно сказывается на показателях роста 1-Ш фаз (рис.1). В наибольшей степени изменение этих показателей при умень­шении Kjj,: наблюдается на IV и V фазах, т.е. на стадиях образования спор и энтомоцидных кристаллов.

Особенно резкие изменения происходят при менее 77 ч^-1. Величина pH остается на уровне 5,2-6,3, длительность спорообразования увеличивается в 5 раз и при самых низких уровнях мас­сообмена уменьшается титр вегетативных клеток. Образование СКК вообще не наступает.

Исключение составляет активность экзопротеаз, которую можно рассматривать как достаточно чувствительный «фор фактор», или показатель изменений, происходящих в клетке. Так, при из­менении К_ы на всем исследуемом диапазоне, активность протеаз изменялась в 20, а скорость их об­разования в 50 раз.

Расчет коэффициента корреляции величины активности протеазы и критерия качества КЖ вы­сок и составляет 0,94. Установлена область значений K_La (77—400 ч¹), преимущественно влияющая на титр спор (рис.2).

Наряду с влиянием массообмена, исследовано также влияние температуры на показатели роста и развития продуцента дендробациллина. Известные из литературы температурные режимы и про­фили ее изменения относительно фаз роста различны и противоречивы, они охватывают широкий диапазон значений: от 26 до 40°С. Оптимизацию температуры проводили с использованием пара­метрической интегральной модели (Ириков, 1988).

Процесс роста был разделен на 5 условных фаз, включающих основные стадии развития куль­туры: лаг-фазу и начало вегетативного роста, экспоненциальную фазу (собственно размножение вегетативных клеток), «гранулез», начало спорообразования, спорообразование до появления еди­ничных свободных спор в культуральной жидкос­

ти, массовое «высыпание» спор, т. е. освобождение их из клетки.

В результате оптимизации получен профиль температуры: (29 - 34,5 - 33,5 - 28°С), реализация которого обеспечивает увеличение титра спор на 15% при сохранении биологической активности с дополнительным эффектом — сокращением дли­тельности культивирования на 5 ч. Необходимо от­метить, что для технологии это очень важный параметр.

Интересной особенностью процесса в отличие от регламентного, является необходимость увеличе­ния температуры с 29 до 34,5°С на участке, соответ­ствующем интенсивному тепловыделению куль­туры, что позволяет экономить хладоагент пример­но на 20% . Полученные результаты апробированы и подтверждены на аппаратах объемом 63 м³ на за­воде.

По данным более, чем двухлетних сравнительных исследований биологической активное КЖ, было установлено, что при выращивании продуцента на средах ПКС и ДПС она отличает почти вдвое: 7,5 ± 0,5 • 10⁶ и 15,4 ± 2,8 • 10^е спор/мл, соответственно.

Показано, что одним из факторов, положительно влияющих на JIK50, является гидролизат. Такі образом, использование способа культивирования продуцента на поликомпонентных средах обеспеч вает более полную реализацию его потенциальных возможностей. Это подтверждено при культивир вании низкоактивных штаммов. Величина ЛК₅₀ в этих случаях составляла 22 - 89,9 • 10^вспор/г (ПКС), в то время как при выращивании на ДПС величина ЛК₅₀ составляла 1120 - 550 • 10⁶ спор/м

Путем электронного микроскопирования и морфометрического анализа было показано, что р комендуемые условия культивирования позволяют получать более крупные энтомоцидные кри таллы. Так, длина опытных кристаллов составила 1,18 ± 0,18, ширина 0,49 ± 0,01 мкм проті контрольных с размерами 0,84 ± 0,17 и 0,36 ± 0,06 мкм, соответственно.

Пропорционально размерам увеличился их объем с 0,021 до 0,047 мкм³. Сравнительный аналі состава белков кристаллов, полученный электрофорезом в 10 % ПААТ с 0,1 % додецилсульфа натрия и 8 М мочевиной, показал, что различия фракционного состава белков несущественны.

Таким образом, повышение активности, не исключая возможные другие факторы, может бы объяснено увеличением общей дозы токсина, вносимого в организм насекомого с более крупным энтомоцидными кристаллами.

Наблюдающаяся интенсификация биосинтеза экзопротеаз в 5-8 раз, увеличение продукти ности по биомассе в 1,7-2,0 раза при одновременном снижении концентрации основного питани: дрожжей и муки на 9%, повлияли на физико-химические свойства КЖ, в том числе на фракщ онный состав частиц твердой фазы. Так, наряду с увеличением вдвое фракции мелких частиц ра мером < 45 мкм , содержание крупных частиц (> 100 мкм) уменьшилось в 1,7 раза, а самы крупных (> 50 мкм ) почти в 3 раза. Этот факт очень важен при использовании препарата на меі те его применения, так как рабочий раствор приготовляется из сухого концентрата и воды. Очек важно иметь рабочую суспензию, не забивающую сопла опрыскивающей аппаратуры.

3.