Штаммы-продуценты аргинина и методы их получения

Представления о механизмах, контролирующих биосинтез данной аминокислоты, о взаимосвя­зи путей ее синтеза с синтезом других метаболитов составляют ту теоретическую основу, на кото­рой обычно строится схема селекционной работы, предусматривающая получение определенных типов мутантов, свойства которых должны отвечать ряду поставленных требований.

Сверхсинтез аминокислот обычно не наблюдается у диких штаммов микроорганизмов. Исклю­чение составляют продуценты глутаминовой кислоты, аланина и валина. Целью селекционной работы является преобразование метаболизма таким образом, чтобы вызвать сверхпродукцию желаемой аминокислоты. Это достигается методами селекции, направленными на устранение не­гативного контроля биосинтеза целевого продукта (т.е., устранение факторов, определяющих ин­гибирование и репрессию его синтеза).

Накопление интермедиатов может осуществляться в результате генетического блокирования метаболического пути и лимитации необходимого для роста продуцента конечного продукта. Т.е., в клетке блокируется биосинтез и, как следствие, накопление веществ, подавляющих образование целевого продукта или вызывающих его отток (либо его предшественников) на свой биосинтез. Блокированное вещество вносится затем искусственно в питательную среду в минимальных кон­центрациях, необходимых для развития культуры. При правильном выборе вещества, по которому создается ауксотрофность, реализация этого метода позволяет резко увеличить биосинтетическую способность штамма. В этом состоит принцип использования ауксотрофных мутантов в производ­стве аминокислот. Часто целесообразно создание дефекта по гену первого фермента боковой ветви пути биосинтеза. Если целевой продукт не конечный в данном метаболическом пути, то инактива­ция фермента дальнейшего превращения этого вещества также может оказаться необходимым. У полученных ауксотрофных мутантов сверхсинтез целевого продукта может быть обусловлен тем, что ингибирование или репрессия первого фермента общей части пути носит поливалентный характер, так что избыток одного конечного продукта при дефиците второго не приводит к подав­лению его активности.

Другим методом селекции является получение мутантов с нарушенной регуляцией биосинтеза целевого продукта, что чаще всего достигается отбором мутантов, устойчивых к структурному ана-

логу целевого продукта. Аналог, добавленный к минимальной среде, на которую высеяно газоном большое количество клеток исходного штамма, воздействует на регуляторную систему клеток, имитируя избыток природной аминокислоты, антагонистом которой он является. Синтез амино­кислоты прекращается, клетки испытывают голодание по этой аминокислоте. Расти и образовы­вать колонии могут только мутанты, у которых нарушена регуляция биосинтеза целевого продук­та (регуляторные мутанты). Такие мутанты называются аналогорезистентными.

Механизм аналогорезистентности определяется типом регуляции: если контроль осуществляет­ся на уровне транскрипции (т.е. по механизму репрессии), то отбираются частично или полностью дерепрессированные мутанты; если же биосинтез продукта контролируется по типу ретроингиби­рования, то отбираются клоны с ферментом, нечувствительным к ретроингибированию, т.е. десен­сибилизированным. Так как фенотип резистентности к аналогам аминокислот может быть след­ствием мутаций как регуляторных, так и различных структурных генов, то использование этого метода при всей его эффективности часто дает неожиданные, в том числе негативные результаты из-за недостатка сведений о причинах резистентности.

Для повышения продуктивности, как правило, применяют комбинацию ауксотрофности и ана­логорезистентности, т.е. в результате селекции получают штамм, ауксотрофный по одному (редко двум) ключевым веществам (в случае продуцентов аргинина это преимущественно аминокислоты и пиримидины, образование которых связано с его биосинтезом) и устойчивый к различным ана­логам целевого продукта (т.е. веществам, которые ингибируют биосинтез целевого продукта, не выполняя при этом в клетке его функций).

Продуценты, пригодные для промышленного применения, обычно проходят многоэтапную ступенчатую селекцию на устойчивость к целому ряду аналогов целевой аминокислоты и несут не­сколько мутаций, повреждающих те или иные механизмы регуляции как самой аминокислоты, так и ее предшественников. Большое количество мутаций обеспечивает высокий уровень накопле­ния продукта и конверсии источников углерода в целевую аминокислоту, но может сильно осла­бить жизнеспособность штамма. Основной причиной этого является накопление в ходе последова­тельных циклов мутагенеза мутаций, которые инактивируют биосинтетические функции штамма (например, могут быть затронуты гены репликации, транскрипции и др.).

Если для данного вида микроорганизмов выяснены закономерности и разработаны методы гене­тического обмена, то отпадает необходимость в длительной ступенчатой селекции. Мутации, полу­ченные в разных линиях селекции, можно объединить в одном геноме. В последнее время в селек­ции продуцентов аминокислот активно используются методы генной инженерии, позволяющие повышать дозу генов биосинтеза аминокислот путем их клонирования на плазмидах.

В настоящее время известен ряд продуцентов аргинина, включающий аналогорезистентные му­танты Corynebacterium glutamucum, Bacillus subtilis и Serratia marcescens, а также рекомбинантные штаммы Escherichia coli. Аэробные, спорулирующие, грамположительные микроорганизмы, относи­мые к роду Bacillus, — эффективные продуценты аминокислот. В. subtilis является классическим ге­нетическим объектом, для анализа которого применяются генетическая трансформация и трансдук- ция. Е. coli и S. marcescens относятся к энтеробактериям — многочисленной группе грамотрицатель­ных нефотосинтезирующих бактерий.

Сверхпродукция аргинина у коринебактерий коррелирует с десенсибилизацией АГК и увеличе­нием удельной активности АГК, КФС и некоторых других ферментов. Широко используются штам­мы, резистентные по 6-азаурацилу, гидроксамату аргинина, D-аргинину, канаванину, 2-тиазолала- нину, аргинингидроксамату, 8-азагуанидину, сульфагуанидину, D-серину, цистеину и его анало­гам. Некоторые ауксотрофные мутации, в частности, чувствительность к гистидину, треонину, триптофану, лизину, гуанину, также повышают уровень продукции аргинина у его продуцентов.

Штаммы-продуценты аргинина, используемые при разработке данного процесса биосинтеза аргинина, были получены селекционным путем в ФГУПГосНИИгенетике в 1995-1997 гг. Ю. А. Рыбаковым и Т.В. Леоновой. В качестве объекта исследования был выбран дикий штамм Brevibacterium flavum АТСС 14067, относящийся к группе глутаматсинтезирующих бактерий. В качестве селективных факторов при получении продуцентов аргинина использовали его ана­логи — канаванин (Сап), гидроксамат аргинина (ArgHx), а также аналог урацила 6-азаурацил (AU). Кроме того, был использован цистеин (Cys), поскольку среди устойчивых к нему штам­мов С. glutamicum высокой частотой отбираются варианты с повышенным уровнем биосинтеза аригинина.

Для каждого соединения определяли уг­нетающие рост концентрации и показыва­ли, что добавление аргинина в среду устра­няет ингибирующее рост действие аналога.

При проверке более 600 вариантов, устой­чивых к различным аналогам, в группе му­тантов, растущих в присутствии 1,0 мг/мл AU, был выбран клон А1 (рис. 7), продуци­рующий 0,3 г/л аргинина. Путем двухсту­пенчатой селекции на устойчивость этого клона к AU (до 2,5 мг/мл) был выделен вариант НЮ, синтезирующий до 1 г/л арги­нина, а среди его цистеинрезистентных про­изводных — штамм М12 с уровнем накопле­ния аминокислоты 2,5 г/л.

В дальнейшем этот штамм был исполь­зован в качестве исходного для двух незави­симых линий отбора.

Рис. 7. Схема селекции продуцентов аргинина AUr, ArgHx-r, Cys-r, Can-r, Sulf-r, Fa-r, KM-r — устойчивость к 6-азаурацилу, гидроксамату аргинина, цистеину, канаванину, сульфагуанидину, монофторацетату и кетомалонату, соответственно

Второй подход включал получение мутантов с изменениями в энергетическом метаболизме, активизация которого могла бы благоприятно сказаться на продуктивности. На начальном этапе от­бор проводили по устойчивости клеток к сульфагуанидину (1,5 мг/мл). Поскольку в культуральной жидкости мутантов присутствовали наряду с аргинином значительные количества глутаминовой кислоты (7-8 г/л), а также примеси аланина (3-4 г/л) и валина (1-2 г/л), в обеих линиях среди про­дуктивных по аргинину клонов отбирали варианты с минимальным содержанием глутамата.

Результатом селекции в указанных направлениях стало получение двух клонов, VM30 и 60, продуцирующих 4 г/л аргинина и глутамата не более 2 г/л. Содержание остальных побочных кис­лот не изменилось. Линия штамма 60 была продолжена получением мутантов, резистентных к сме­си аналогов интермедиатов ЦТК монофторацетату (FA, 0,5 мг/мл) и кетомалонату (КМ, 1,5 мг/мл), устойчивость к которым также сопровождается изменениями энергетического обмена клетки и мо­жет проявляться в уменьшении оттока пирувата на образование аланина и валина. У одного из ото­бранных мутантов, 168, уровень накопления аргинина достиг 5 г/л.

На следующем этапе селекции методом обогащения были получены производные штаммов VM30 и 168, ауксотрофные по ряду аминокислот и оснований, прямо или косвенно связанных с путем био­синтеза аргинина.

Среди более чем 60 ауксотрофов по пролину, изолейцину, гистидину, урацилу и гуанину были выбраны штаммы, превышающие родительские по уровню продукции на 20-40 % .

При ферментации на исходной питательной среде штаммы накапливали: Br. flavum 60 — 4 г л аргинина, VM30 — 5, 168 — 5, 174(His~) — 7, 2(Gua ) — 5,5, 4(І1е“) — 5, 194(Pro ) — 8, 83(Pro ) — 8 г/л. Штаммы накапливали в культуральной жидкости большое количество побочных аминокис­лот (аланина, валина, лейцина, гистидина), а также аминокислоты, чей биосинтез связан с биосин­тезом аргинина — глутаминовую кислоту, глутамин, цитруллин, орнитин.

Сравнение полученных штаммов-продуцентов при оптимальных для них концентрациях ауксо- трофного фактора показало, что наибольшим уровнем накопления аргинина характеризуются штаммы-продуценты, ауксотрофные по пролину — 83(Рго ) и 194(Рго ), что обусловлено прекращением оттока общего предшественника — глутаминовой кислоты на образование пролина (табл. 1). Дальнейшая работа по созданию технологии биосинтеза L-аргинина было построена на ис­пользовании в качестве продуцентов пролинзависимых штаммов.

Табл. 1. Сравнение биосинтетических возможноетей продуцентов аргинина

3.