Способ получения коэнзима В12 из биомассы пропионовокислых бактерий

Для получения коэнзима В₁₂ была использована биомасса пропионовокислых бактерий, пол ченная при промышленном культивировании Р. shermanii или его высокопродуктивных мута тных вариантов при 28-30 °С в течение 112 ч на среде следующего состава (в %): глюкоза — кукурузный экстракт — 6; сернокислый аммоний — 0,2; кобальт хлористый — 0,005, pH сред поддерживали в пределах 6,8-7,0 путем периодической нейтрализации 40 Ф -ным раствором едк го натра.

Предварительные исследования показали, что в такой биомассе количество кобамидного кофе мента составляет 75-80 % от суммы кобамидов.

«321

По первому способу биомассу пропионовокислых бактерий, отделенную от маточного раствора путем сепарирования или фильтрации, гидролизуют подкисленной водой (pH 4,55,0) при темпера­туре 85-90 °С в течение 1-2 ч без внесения каких-либо соединений, могущих вызвать разложение коэнзима В₁₂, например, цианистых, роданистых, нитратных, нитритных или сульфитных солей.

Все дальнейшие операции проводятся либо в сильно затемненных помещениях, либо при крас­ном или рассеянном слабом синем свете для предотвращения фотохимического разложения коэн­зима В₁₂.

По окончании гидролиза отработанную биомассу отделяют фильтрацией или сепарированием. Коэнзим В₁₂ адсорбируют на активированный уголь марки А или Б при pH 5,0 в течение 1-2 ч при перемешивании. Вместо активированного угля могут быть также применены смолы ИА-1Р, ИА-1Ф или ИА-1. Адсорбцию в этом случае проводят при pH 7,0 как в статических условиях, так и при пропускании гидролизата через колонку со смолами.

Коэнзим В₁₂ десорбируют с угля или смолы 25%-ным водным раствором изопропилового спир­та (уд. вес 0,964) при pH 4,5 и температуре 80-85 °С . Десорбцию можно проводить 20% -ным водным пропанолом и 15 % -ным водным бутанолом при pH 4,5 и 75 °С , а также 70% -ным водным ацетоном при pH 6,0 и комнатной температуре.

Изопропанол отгоняют под вакуумом при pH 6,5-6,8. Из полученного водного раствора коэнзим В₁₂ экстрагируют смесью крезол-четыреххлористый углерод (1:1 об./об.). Крезольный экстракт промывают 3-4 раза водой. Затем к нему добавляют 1,3 объема четыреххлористого углерода и 0,8 объема изопропанола и проводят водное извлечение коэнзима В₁₂ путем многократной экстрак­ции дистилированной водой.

Водный раствор коэнзима В₁₂ промывают четыреххлористым углеродом и серным эфиром, а за­тем упаривают в вакууме до коцентрации коэнзима В₁₂ 9-10 мг/мл.

К упаренному концентрату коэнзима В₁₂ добавляют три объема ацетона и проводят хроматографию на окиси алюминия путем последовательной элюции водным ацетоном различных концентраций.

Вначале проводят отмывку от продуктов деградации и загрязняющих примесей 80% -ным аце­тоном; затем 60 % -ным ацетоном элюируют оксикобаламин и цианокобаламин, некоторое количе­ство которых могут образоваться вследствие незначительного разложения коэнзима В₁₂, а также наличия следов цианистых соединений в исходной среде и реактивах. Оксикобаламин и цианоко­баламин передают на дополнительное цианирование и очистку для получения кристаллического цианокобал амина.

Собственно коэнзим В₁₂ элюируют 40-45%-ным водным ацетоном. О начале элюции судят по резкому переходу глубоко-красного цвета раствора коэнзима в пробах в интенсивно желтый при изменении pH раствора от 7,0 до 5,0 при подкислении уксусной или соляной кислотой. Растворы цианокобаламина или оксикобаломина таким свойством не обладают.

По окончании элюции добавляют ацетон до слабой опалесценции и раствор выдерживают при 3-4 °С в течение 1-2 суток. При выдерживании выпадают кристаллы коэнзима, имеющие вид ром­бических пластинок темно-красного или алого цвета. Кристаллы отфильтровывают, промывают сухим ацетоном и серным эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе над пятиокисью фосфора.

Данный способ получения коэнзима В₁₂ можно использовать в различных модификациях в за­висимости от конкретных условий производства.

Например, для экстракции коэнзима В₁₂ рекомендуется применять не только сырую биомассу бактерий, но и биомассу, высушенную методом распылительной сушки. Это дает возможность по­лучать более концентрированные растворы последнего.

Как уже отмечалось, адсорбцию коэнзима можно вести как на активированном угле, так и на смолах ИА-1Р, ИА-1Ф и ИА-1. Десорбция коэнзима проводится рядом низших спиртов и ацетоном.

Вместо очистки смесью крезол-четыреххлористый углерод вполне применима очистка смесью фенол-четыреххлористый углерод, в обоих случаях четыреххлористый углерод хорошо заменяет­ся хлороформом.

Кристаллизация коэнзима В₁₂ хорошо проходит как из его водно-ацетонового раствора, так и из раствора, содержащего помимо ацетона серный эфир.

Выход коэнзима В₁₂ по данному способу составляет 20—25 % от общего содержания корриноидов в биомассе бактерий.

По второму способу коэнзим В₁₂ сорбируют их гидролизата не на активированный уголь, а на ионообменные смолы, например, на слабокислотный карбоксильный катионит СГ-1. Сорбцию проводят при pH 3,5-4,0. В этих условиях другие производные витамина В₁₂ такие как цианокоба­ламин, оксикобаламин, присутствующие в гидролизате, почти не сорбируются , поскольку опти­мальный pH для их сорбции на эту смолу 2,5-2,7 и ниже. Прочие пигментные примеси также

Табл. 4. Выделение и очистка коэнзима В₁₂ ^при применении ионообменного метода

почти не сорбируются на смолу СГ-1.

Коэнзим элюируют со смолы 0,05—0,1 и водным раствором аммиака и концентрируют путем упаривания под вакуумом (35-40 °С ) до концентрации 6,5-10 мг/мл.

Дальнейшую очистку коэнзима В₁₂ (хроматография на окиси алюминия) и кристаллизацию проводят согласно описанным выше методам.

Выход коэнзима В₁₂ по предлагаемому способу составляет 42,5 % от содержания корриноидов в биомассе бактерий. Чистота кристаллов 93,4 %, влажность — 4,25 % (табл. 4).

Кристаллы коэнзима B_J2 темно-красного цвета, без запаха и вкуса, имеют вид шестигранных призм ромбической формы, растворимы в воде, трудно растворимы в 95 % -ном этаноле, практичес­ки нерастворимы в хлороформе, ацетоне и серном эфире.

Растворы, содержащие 20 мкг/мл препарата а 0,03М ацетате натрия (pH 6,7), имели максимумы поглощения при 259-261 нм, 337 нм, 375 нм и 523 нм, что характерно для коэнзима В₁₂.

Экспозиция раствора препарата на види­мом свету (например, при освещении 100 Вт лампой накаливания с вольфрамовой нитью в течение 30 мин) приводила к образованию оксикобаламина, имеющего максимумы пог­лощения при 350-353 нм. Обработка водного раствора коэнзима В₁₂ цианистым калием вызывала образование цианокобаламина (рис. 5).

Электрофорез в 0,5 н уксусной кислоте при 700 В также подтвердил, что выделен­ное соединение является коэнзимом В₁₂ (рис. 6). Наконец, энзиматические иссле­дования показали, что полученный про- Рис. 5. Абсорбционные спектры коэнзима в її (1), выделенного дукт обладает активностью в зависимой от из биомассы Р. shermanii., и продуктов его трансформации КОЭНЗИМа В₁₂ ГЛ И церол-ДЄ ГИ дратазной после освещения (2) и обработка цианистым калием (3) реакции.

2.2.