Культивирование клеток тканей животных и растений

Центральной ведущей стадией, определяющей успех всего производства в целом, является культивирование клеток-продуцентов от исходной до конечной концентрации в заданное время при определенных оптимальных условиях (состав питательной среды, ее pH, температура, осве­щенность, концентрация растворенного кислорода и диоксида углерода, интенсивность перемеши­вания и др.).

В зависимости от свойств клеток и принятой технологии их можно культивировать поверхнос­тным или глубинным способом. Глубинный или суспензионный способ реализуют в одном из сле­дующих режимов: периодическом, полунепрерывном (отъемно — доливном) или непрерывном; осуществляя при этом поверхностную или барботажную аэрацию.

При периодическом суспензионном культивировании посевная доза клеток животных состав­ляет около 0,3 млн общего числа клеток на 1 л среды в биореакторе при доле живых клеток около 95%. При культивировании клеток на микроносителях концентрация последних в культуре составляет около 2 г/л. Общую концентрацию с одновременным подсчетом доли жизнеспособных клеток определяют оптическим методом под микроскопом в камере Горяева. Перед подсчетом кле­точную суспензию смешивают с раствором трипанового синего, который окрашивает только нежизнеспособные клетки. Посевная доза клеток растений зависит от вида культуры, но обычно составляет около 4 г/л по сухой биомассе. Ее определяют весовым методом, высушивая до постоян­ного веса аликвоту сырой биомассы, выделенной из культуральной жидкости фильтрацией или це­нтрифугированием. Количество живых клеток должно быть не менее 50%. Жизнеспособность растительных клеток оценивают под микроскопом после обработки препаратов различными кра­сителями, например, метиленовым синим, который проникает через оболочку мертвых клеток, ок­рашивая их в синий цвет.

Величина посевной дозы влияет больше на конечную концентрацию клеток, чем на скорость ее роста. За весь цикл культивирования, длящийся несколько суток (клетки животных) или несколь­ко недель (клетки растений и гибридомы), клетки достигают максимальной концентрации. Типичными значениями ее являются 1-2 млн.кл/мл для клеток животных и 10-15 r/л по сухой биомассе для клеток растений.

Удельная скорость роста в экспоненциальной фазе имеет значение порядка до 0,05 ч¹ для кле­ток животных и 0,5 сутки^-1 для клеток растений. Концентрация лимитирующих компонентов пи­тательной среды определяет не только величину скорости роста, но и максимально достижимую концентрацию клеток.

Культивирование клеток производят в довольно узком температурном диапазоне, составля­ющем для клеток животных 36-ЗГС, для клеток растений 25-28°С. В отличии от культур микро­организмов, где присутствует значительное выделение тепла, культуры клеток животных и расте­ний образуют его в небольшом количестве, не превышающем теплопотери в окружающую среду. Поэтому, если для отвода выделяющегося тепла при культивировании микробных культур обычно подают в теплообменник ферментатора воду с температурой на несколько градусов ниже темпера­туры ферментации, то в биореакторы для культивирования клеток животных и растений — пода­ют воду с температурой весьма близкой к температурному диапазону культивировании. Поддержа­ние температурного режима осуществляют с помощью водяных термостатов.

В процессе культивирования клеток животных и растений устанавливают определенные расход воздуха и число оборотов мешалки для перемешивания культуры и обеспечения ее і езами (кисло­род, диоксид углерода) на постоянном уровне или в соответствии с установленным профилем, меняющемся по ходу культивирования в соответствии с потребностями культуры в кислороде. Ти­пичным является расход воздуха для клеток животных до 0,2 объема на объем в минуту, для кле­ток растений — от 0,3 до 1 объема на объем в минуту.

Скорость мешалки, как и подачи воздуха, устанавливают для каждой культуры в пределах, обеспе­чивающих суспензирование и требуемый уровень массообмена без травмирования клеток. С увеличени­ем масштаба биореактора скорость мешалки уменьшают без снижения эффективности .'. еремешивания благодаря увеличению диаметра ее лопастей, который должен быть пропорционален диаметру аппара­та, а следовательно, его вместимости. По имеющимся данным, в биореакторах вместимостью от 15 до 20000 л, в которых успешно культивировали различные клетки, число оборотов мешалки, п, мин^-1, коррелирует более или менее точно с общей вместимостью аппарата, V, л, следующим образом

п = aV^e,

где а — представляет собой скорость вращения мешалки в аппарате емкостью 1 л и приблизитель­но равно 300, в — приблизительно равно — 0,25.

В эрлифтном аппарате без мешалки перемешивание осуществляется благодаря циркуляции насыщенной воздухом суспензии. Скорость перемешивания, как и интенсивность газовой массопе­редачи зависят от отношения площадей поперечного сечения восходящей и нисхс.гящей зон цир­куляции, а также от скорости потока воздуха в восходящей зоне.

крупных микробных агрегатов соблюдать отношение диаметра трубы и аппарата, равное 0,6; а для достижения высоких значений коэффициента массопередачи кислорода в диапазоне 0,8-0,9.

Более точно интенсивности аэрации и перемешивания в конкретном аппарате следует уста­навливать по их влиянию на коэффициент газовой массопередачи, от которого зависит продук­тивность культуры. Требуемое значение коэффициента массопередачи кислорода определяют экспериментально или расчетным путем, имея данные о максимальном потреблении кислорода культурой при его оптимальной для клеток концентрации.

В общем для клеток животных указывают в качестве оптимальных значения коэффициентов мас­сопередачи кислорода, K_La, равные 1—4 ч^-1; для различных клеток растений — в диапазоне 10 - 30 ч^-1.

При культивировании может проводиться контроль уровня растворенного кислорода в среде, чтобы не допустить снижения его ниже минимального уровня, корректируя для этого интенсив­ность аэрации и перемешивания. Оптимальное значение концентрации растворенного кислорода индивидуально для каждой культуры. Ее обычно выражают в долях от концентрации в данной сре­де при ее равновесии с воздухом. Для клеток животных и растений типичны значения оптималь­ной концентрации растворенного кислорода,

С_опт = (0,2 - 0,5) С_р,

где С_р — равновесная концентрация растворенного кислорода, равная 100% .

Отклонения от указанных значений в ту или иную сторону может привести к некоторому сни­жению продуктивности процесса. Описаны клетки — гибридомы с низкой скоростью потребления кислорода, на которые мало влияет изменения содержания кислорода в среде в пределах от 8 до 100 % от насыщения воздухом.

Таковы общие сведения об основных технологических параметрах процесса культивирования клеток животных и растений. Контролировать влияние этих параметров на качественные и коли­чественные показатели процесса можно только по концентрации клеток и целевого продукта. В настоящее время делать это можно путем периодического отбора проб культуры из биореактора и их лабораторного анализа. При проведении процесса культивирования в две стадии, значения технологических параметров по стадиям могут различаться, но в основном это касается состава среды и длительности процесса культивирования.

2.4.