Исследование токсичности и биосовместимости полимерных пористых матриксов при культивировании шванновских клеток
Биологическая совместимость матриц оценивалась с использованием культуры клеток Шванна, полученных из седалищного нерва самцов крыс линии Вистар. Использована фотополимеризующаяся композиция на основе модифицированного полилактида, полученного в результате поэтапного синтеза.
На первом этапе была получена разветвленная структура, содержащая предельно замещенный атом углерода с четырьмя молекулами лактида. Далее было проведено метакрилирование полученной структуры при проведении реакции с ангидридом метакриловой кислоты. Для создания фоточувствительной композиции на последней стадии предварительного синтеза к системе добавляли инициатор Irgacure 359 (Ciba) в количестве 2% масс. Для создания 3-мерных структур использовался Тксапфировый лазер - 120 фс, 80 МГц и длина волны 780 нм. Выделениие шванновских клеток проводят из срезов седалищного нерва. Срезы нерва инкубировали в растворе коллагеназы (Sigma, UK) 60 минут при 37°С. Полученная суспензия клеток фильртруется через фильтр с диаметром пор 40 мкм (Becton Dickinson, USA) и центрифугируется 5 минут при 400 g. Полученную клеточную массу промывают средой ДМЕМ, содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Полной ростовой средой является среда ДМЕМ (D-валин) (PAA, UK), содержащая 2 mM глутамина, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, добавку N2 (Gibco BRL, UK), 20 мг/мл экстракта бычьего гипофиза, 5 цМ форсколина (Sigma-Aldrich, UK), 100 мкг/мл пенициллина (или 100 мкг/мл стрептомицина) и 0,25кг/мл амфотерицина B. Суспензию клеток высевали в чашке Петри 35 мм, предварительно покрывали 0,01-процентным раствором поли-Ь-лизина (Sigma-Aldrich, UK). Через 7 дней культивирования проводилось иммуноцитохимическое окрашивание маркера глиальных клеток S-100P и DAPI. Биологическая совместимость оценивалась по трем основным параметрам: пролиферация шванновских клеток (в 1-е, 3-и и 7-е сутки культивирования), жизнеспособность клеток (МТТ-редуктазный тест), морфология клеток (с использованием электронной и конфокальной микроскопии). Для изучения морфологии клеток и наличия функциональных связей проводили иммуноцитохимическое окрашивание актинового цитоскелета с помощью фаллоидина и винкулина (для детекции клеточных контактов).Изучена скорость роста шванновских клеток на полимерных пленках и 3-мерных структурах, полученных методом 2-фотонной фотополимеризации. Скорость роста клеток на полимерных пленках и 3-мерных структурах не отличима от скорости роста контрольных культур на всех (1-е, 3- и 7-е сутки) сроках развития культур. Исследование жизнеспособности клеток с помощью МТТ-редуктазного теста также не показало значимых различий между группами. Морфологию клеточных культур на поверхности полимерного матрикса оценивали с помощью сканирующей электронной и конфокальной микроскопии. На рис. 8 представлены электронные микрофотографии клеток Шванна на скаффолде, созданном на основе полилактида (на рис. 9 и 10 аналогичные микрофотографии сделаны с помощью кофокального микроскопа). На рис. 8 видно, что морфология шванновских клеток
Рис. 8. Микрофотографии, полученные в санирующем электронном микроскопе, роста клеток Шванна на пленках фотополимеризующийся композиции на основе полилактида, полученные с разным разрешением: (a) 100* (шкала 1 мм) с вставкой (a’) 4000* (шкала 30 мкм), (б) 445* (шкала 300 мкм), (в) 2011* (шкала 50 мкм) и (г) 588* (шкала 200 мкм)
Рис. 9. Конфокальные микрофотографии клеток Шванна на поверхности фотополимеризованного полилактида: окрашенные TRITC-фаллоидином (красный цвет, филаменты актина) и DAPI (синие, ядра) (а-г); окрашенные TRITC-фаллоидином (для маркировки актиновых филаментов, зеленый), DAPI (синие, ядра), винкулином (для оценки образования фокального контакта, красный) (д, е)
Рис.
10. Иммуномечение клеток Шванна на стекле (а), пластике, покрытом поли-л-лизином (б), и полилактиде (в)
Рис. 11. Микрофотографии СЭМ роста клеток Шванна на 3-мерных матрицах: (a) увеличение 1750*, шкала 50 мкм и (б) увеличение 1250*, шкала 100 мкм. На изображениях видно наличие плоских и веретенообразных клеток
на поверхности пористых биополимеров неоднородна, наряду с распластанными трехполюсными клетками с большой поверхностью в культуре наблюдается большое количество веретеновидных клеток. Распластанная морфология является нехарактерной для шванновских клеток, однако исследование цитоскелета показало наличие в подобных клетках хорошо организованного цитоскелкта и межклеточных контактов. Также было показано, что шванновские клетки способны расти на 3-мерных полимерных конструкциях (рис. 11), создавая специфические морфологические комплексы внутри полимерных структур. Нами использовались матрицы с диаметром пор от 80 до 200 мкм. Клетки способны расти на боковых поверхностях микротрубочек скаффелда, либо, не прикрепляясь, падать на дно полимерной конструкции. Полученные результаты свидетельствуют об успешном росте глиальных клеток на всех типах исследованных структур. Особенности морфологии шванновских клеток на поверхности полимера говорят о высокой адгезивности и биосовместимости материала.
6.
Еще по теме Исследование токсичности и биосовместимости полимерных пористых матриксов при культивировании шванновских клеток:
- Исследование in vitro биосовместимости матриксов на основе гибридной золь-гель-полимерной системы, содержащей Zr, полученных методом двухфотонной фотополимеризации
- Культивирование клеток тканей животных и растений
- Разработка пористых полимерныхматриксов-носителей для нейротрансплантатов
- Режимы культивирования при получении дрожжевой биомассы с высоким содержанием селена
- Микроскопическое исследование живых клеток бактерий
- Особенности пролиферации клеток из зон НПА и ВПА (исследование с помощью радиоавтографии)
- 5.1. Полимерный канцерогенез: некоторые исходныефакты и положения
- Классификация полимерных материалов для МКЛ
- Изменения содержания маркеров межклеточного матрикса
- Особенности пролиферации клеток из зон НПА и ВПА (исследование с помощью кривых роста)
- Изменения клеток при старении.
- Исследование барабанной полости и клеток сосцевидного отростка
- 2. Разработка пористых матриц-носителей с использованием сверхкритических флюидных технологий
- Модель нейропатической боли при введении опухолевых клеток в костные структуры