Обеспечение асептических условий в технологии культур клеток животных и растений

Биотехнология для своего осуществления решает сложную проблему защиты чистоты соб­ственных процессов и продуктов от загрязнений, источником которых являются персонал и окру­жающая среда, с одной стороны, и персонала и окружающей среды от рабочих сред и продуктов, с другой стороны.

Приготовление питательной среды, как и все стадии производства, предшествующие основному культивированию, должны обеспечивать асептичность этого процесса. Компоненты питательной среды должны храниться в условиях, при которых их загрязнение микробами было бы мини­мальным, а химическая контаминация вообще невозможна. Приготовление растворов питатель­ной среды осуществляют на воде той категории очистки, которая указана в технологическом рег­ламенте. Для клеток животных требуется вода высокой степени очистки (удельное сопротивление до 18 МОм/см), достигаемой методами дистилляции, ионного обмена и обратного осмоса. Этой же водой рекомендуют ополаскивать внутренние полости аппаратов для приготовления среды и куль­тивирования клеток, а также получать из нее пар, используемый в виде «острого» для стерилиза­ции аппаратов и питательной среды. Для клеток растений в указанных выше случаях применяют дистиллированную воду.

Для решения проблем стерилизации питательных сред необходимо использовать теоретические и практические разработки, выполненные в классической биотехнологии, особенно в части опреде­ления оптимальных режимов стерилизации среды, оборудования, трубопроводов и арматуры. Доказано, что термическая стерилизация обладает одним главным преимуществом по сравнению с другими, известными к настоящему времени — надежностью — и одним главным недостатком — разрушением некоторых веществ в питательной среде.

Термическая стерилизация питательных сред осуществляется как путем нагревания их во­дяным паром через поверхность контакта («глухим» паром), так и прямым вводом пара в среду («острым» паром). В последнем случае пар в виде конденсата попадает в питательную среду в дос­таточно больших количествах, достигающих 20% . Поэтому может потребоваться очистка пара от примесей, содержащихся в капельках питающей воды, уносимых паром из парового котла, а так­же поступающих в пар в виде продуктов коррозии при движении его по трубопроводам, выпол­ненным из углеродистой низколегированной стали. Однако в рассматриваемых технологиях, которые считаются особо чистыми, но в которых требования к чистоте пара фактически точно не определены, принято для гарантии получать пар из воды того же качества, что применяют для приготовления питательной среды. Очищенный пар должен подаваться к месту потребления по трубопроводу из нержавеющей стали.

В зависимости от объема производства, стадия приготовления питательной среды может быть размещена в отдельном или совмещенным с другими стадиями помещении. Для определенного ко­нтроля окружающей среды с целью защиты работающих и предотвращения перекрестной конта­минации для манипуляций с твердыми компонентами среды рекомендуется использовать вытяж- ной шкаф, а при большом объеме работы — так называемые ламинарные шкафы с однонаправ­ленным нисходящим потоком.

Главнейшим требованием к посевному материалу, кроме оптимальной концентрации клеток, является отсутствие посторонней микрофлоры. Очевидно, работа с посевной культурой при использовании лабораторной посуды и оборудования (пробирки, чашки, матрацы, колбы, лабора­торные ферментаторы) должна проводиться в боксированных помещениях, оборудованных лами­нарными шкафами типа «для защиты продукта от окружающей среды». В целях обеспечения защиты от посторонней микрофлоры желательно использовать более простые конструкции и схемы обвязки посевных ферментаторов по сравнению с головным биореактором (см. выше). При возможности используют аппараты с пневматическим перемешиванием или с магнитным приво­дом вала мешалки. Аппарат должен иметь минимальное число штуцеров. Из обвязки исключают также по возможности емкости с пеногасителями, титрантами и другими добавками, некоторые датчики, если в них нет необходимости при проведении конкретного процесса.

Для обеспечения асептических условий культивирования клеток биореактор должен быть надежно загерметизирован; воздух, подаваемый на аэрацию, необходимо очищать и стерилизо­вать, а подачу стерильных добавок и отбор проб осуществлять с соблюдением правил асептики.

Герметичность аппарата проверяют до и после стерилизации его совместно с обвязкой и воз­душными фильтрами. Наиболее простая проверка герметичности осуществляется по падению дав­ления в аппарате с «обмыливанием швов». Наиболее надежным и чувствительным является тест с галоидным течеискателем. Воздух, подаваемый в биореактор, должен быть практически стерильным, несмотря на высокое содержание микроорганизмов в воздухе (около 10⁴ кл/м³) и большой расход воздуха на аэрацию культур (для клеток растений до 20000 об/об за цикл роста).

Соблюдению асептических условий при культивировании клеток способствует поддержание в производственном помещении требуемого уровня чистоты. Следует признать, что этот уровень не обоснован никакими строгими теоретическими или экспериментальными исследованиями, а при­нимается интуитивно. Однако имеющийся опыт показал, что при работе в биореакторе с надежной герметизацией даже с такими высокочувствительными к микробной контаминации культурами, как перевиваемые линии клеток млекопитающих, вполне достаточно поддержания в рабочем по­мещении положительного давления с подачей стерильного воздуха, систематическая обработка по­верхностей помещения дезраствором типа перекиси водорода, переодевание персонала в чистую одежду (пижаму, тапочки), проход в рабочее помещение через воздушный шлюз с надеванием до­полнительной одежды (халаты, тапочки). Для создания этих условий в помещениях для культиви­рования клеток необходимо иметь класс чистоты по вышеуказанным правилам GMP.

На всех стадиях технологического процесса после культивирования клеток также соблюдается асептика в той степени, которая необходима для обеспечения требований, предъявляемых к гото­вой продукции в соответствии с нормативно-технической документацией к ней. Наиболее строги­ми являются требования к лекарственным средствам, в качестве готовых форм и субстанций которых могут выступать продукты биотехнологии. Следует иметь в виду, что на долю заключи­тельных стадий переработки материала, полученного со стадии культивирования, приходится до 50% от общих капитальных затрат и эксплуатационных расходов. Поэтому так важно на этих ста­диях не допустить потерь качества целевого продукта, например, из-за инактивации, денатура­ции, а также предохранить его от биологического и химического загрязнения.

Основные способы борьбы с микрозагрязнениями при проведении процессов биотехнологии клеток животных и растений, изложенные выше, по существу, основываются на методах, отрабо­танных в классической биотехнологии при культивировании микроорганизмов.

По степени опасности микроорганизмы во всем мире делят на четыре основные группы: безопасные, низкого, среднего и высокого риска. В первую из названных групп входят микроорганизмы, которые обычно не вызывают заболеваний человека. Таких микроорганизмов большинство из используемых в биотехнологии. К ним обоснованно могут быть отнесены клетки животных и растений, если они не инфицированы вирусами, относящимися к более высоким группам опасности, или другим опасным

веществам, вызывающим заболевания. При работе с микроорганизмами первой группы ставят общие требования безопасности с целью обеспечить гигиенические требования при этой работе. Выполнение гигиенических требований обеспечивает предотвращение контаминации культуры или продукта. Основные требования гигиены и безопасности опираются на следующие принципы:

- разработка и внедрение конкретных правил безопасности для персонала, осуществление адекватного контроля за их выполнением;

- разработка инструкций и тренировка персонала с целью обеспечения чистоты и порядка на рабочих местах и резерва биологических, химических и физических средств в мини­мально необходимом для практических нужд количестве;

- создание устройств для мытья рук;

- запрещение приема пищи, питья и курения на рабочих местах.

Как видно, все эти требования обеспечения безопасности практически перекрываются требова­ниями чистоты и стерильности проведения технологических процессов культивирования клеток и получения на этой основе многих продуктов. Те мероприятия, которые требуются при проведе­нии работ с микроорганизмами других групп, если, например, их даже выращивают в культурах клеток животных, к последним напрямую не относятся и поэтому здесь не рассматриваются.

Дополнительная литература

1. Пинаев Г.П. Методы культивирования клеток./Л.: Наука, — 1988. — 319 стр.

2. Васильев Н.Н., Амбросов В.А., Складнев А.А.

3. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе./М.: ФБК- Пресс, — 1999. — 180 стр.

4. Лутова Л. А. Биотехнология высших растений./Издательство Санкт-Петербургского университета, — 2003. — 328 стр.

Контрольные вопросы

1. Определите понятия культура клеток животных и растений и промышленная биотехнология клеток.

2. Приведите примеры продуктов, получаемых на основе клеток животных и растений.

3. Укажите основные типы культур клеток животных и растений.

4. Изложите особенности культур клеток животных и растений в сравнении с культурами микро­организмов.

5. Изложите основные стадии производств продуктов методами клеточной биотехнологии.

6. Укажите основные компоненты питательных сред для культивирования клеток животных и растений.

7. Опишите методы стерилизации питательных сред для культур клеток животных и растений.

8. Изложите основные технологические параметры процессов культивирования клеток животных и растений.

9. Опишите в общем процесс получения некоторых продуктов из клеток животных.

10. Укажите, на какие группы можно разделить целевые продукты из клеток растений, и опиши­те в общем процесс выделения их в каждой группе.

11. Опишите основные типы биореакторов для культивирования клеток животных и растений.

12. Изложите, какие технические решения и разработки используют для комплектации элементов биореактора и его обвязки (привод мешалки, воздушные фильтры, запорно-регулирующая армату­ра) с целью повышения надежности работы установки.

13. Укажите технологические параметры, регистрируемые и управляемые с помощью контрольно­измерительных приборов и средств автоматизации (КИП и А) в процессе культивирования клеток.

14. Отметьте основные мероприятия по обеспечению биологической и химической чистоты процес­сов клеточной биотехнологии.

15. Охарактеризуйте правила биологической защиты при культивировании клеток животных и растений.

2.