Хроматография

В биологических растворах часто оказывается смесь близких по природе веществ, имеющих в то же время различную биологическую активность. Сорбенты при этом адсорбируют всю эту смесь, да и при десорбции в конечном счете все эти вещества выделяются вместе, хотя и очищенными от дру­гих загрязняющих веществ.

Рис. 34. График изменения во времени концентрации десорбируемого вещества в элюате. С — концентрация вещества в элюате; 1 — время от начала десорбции (элюиро вания); tj, t₂, t_s, t₄ — интервалы времени для сбора различных фракций элюата, содержащих различные вещества

Эту задачу выполняет процесс хрома­тографии. При хроматографии поток элюента, выходящий из слоя сорбента, не собирается весь в одну емкость, а фракци­онируется по времени пропускания элю­ента через колонку.

Рис. 35. Принципиальная схема аффинной адсор­бции молекул фермента. Л — лиганд;

М — матрица (подложка); Б1, Б2 — балластные вещества; В1, Б2 — низкомолеку­лярные примеси

Дело в том, что десорбция разных по молекулярной массе или, точнее, разных по сродству к сорбенту веществ протекает с разной скоростью. Поэтому сначала в поток перейдут вещества с меньшей молекулярной массой и менее связанные с сорбентом, а затем все бо­лее и более трудно десорбируемые. Ес­ли измерять концентрацию вещества в потоке элюента во времени, то можно наблюдать ряд пиков различной вы­соты, разделенных участками низкой концентрации (рис. 34). За основу раз­деления берется время выхода, отсюда и название метода («хрома то* — время).

Рассмотренный пример можно назвать адсорбционной хроматографией, он основан на повер­хностном связывании растворенного компонента.

Интересной разновидностью хроматографии в биотехнологии является так называемая «аффинная хроматография*, или более точно биоаффинная, или биоспецифическая хрома­тография. Ее суть заключается в том, что многие биологически активные соединения, в том числе и ферменты, имеют исключительную способность специфически и обратимо связывать­ся с другими веществами, которые принято называть лигандами, аффинными лигандами или просто аффинатами. Если такой лиганд (Л) ковалентно соединить с нерастворимой инертной матрицей (М), то получится специфический адсор­

бент, на котором будут адсорбироваться только белки, имеющие сродство к данному лиганду. Остальные нее вещества (В) и белки (Б) будут транзитом проходить через колонку (рис. 35).

Варьируя условия процесса и используя специальные элюенты, которые изменяют сродство лиганда к фермен­ту, можно вызвать десорбцию белка и получить практи­чески в один прием высокоочищенный препарат.

Преимущества хроматографии:

• высокая селективность;

• возможность разделения веществ с близкими свойствами;

• мягкие условия проведения процесса.

Недостатки:

• более сложное аппаратурное оформление про­цесса;

• обычно более разбавленные растворы;

• более низкая скорость десорбции, необходимая для улавливания разных «пиков» выделения веществ.

В препаративной энзимологии для очистки неста­бильных ферментов часто применяют их разделение в мягких условиях, когда фермент в течение всей проце­дуры очистки находится в растворимом состоянии. На­иболее широкое распространение среди этих методов по­лучили гель-фильтрация, а также электрофорез, изоэле­ктрическое фокусирование, изотахофорез, метод распределения белков между жидкими несмеши- вающимися фазами и некоторые другие.

Наибольшее практическое значение в технологии ферментных препаратов получила гель- фильтрация. Термин «гель-фильтрация» не очень удачен, но он широко распространен в литера­туре. Предлагалось несколько названий этого процесса (гель-проникающая хроматография, мо­лекулярно-ситовая хроматография), но все же общепризнанным остается гель-фильтрация. Для осуществления этого процесса чаще всего используются гели, полученные на основе декстрана, с помощью которых можно быстро разделить макромолекулы в соответствии с их размером. Гель состоит из открытой поперечно-сшитой трехмерной молекулярной сетки, сформированной в ви­де гранул для удобства заполнения колонок. Гранулы имеют поры, которые недоступны для крупных молекул, но более мелкие молекулы проникают во все поры. Недоступность пор может быть двух видов: либо они узки для крупных молекул, либо широкие поры не имеют выхода на поверхность гранулы

3.7.4.