Метод определения проницаемости кишечной стенки для антигенного белка ОВА

Проницаемость тонкой кишки для макромолекул ОВА изучали по его концентрации в сыворотке периферической крови у крыс, получавших внутрижелудочно белок куриного яйца. Анализ ОВА проводили с помощью твёрдофазного двухвалентного иммуноферментного теста согласно официальному методу ВОЗ [155]с незначительными модификациями.

Сенсибилизация антител. В каждую лунку полистирольной планшеты со средней степенью связывания вносили по 2 мкг моноспецифических антител кролика к ОВА, очищенных методом аффинной хроматографии, в 0,1 мл 0,1 M Na-бикарбонатного буфера рН 9,2. Адсорбцию антител проводили в течение 16 ч при +4^оС в холодильнике. Затем лунки планшеты трижды отмывали раствором PBS с 0,1% Твин-20 (производства фирмы “Sigma-Aldrich”, Германия), вносили по 0,2 мл блокирующего реагента - 1% раствора желатины в 0,01 M Na- фосфатном буфере рН 7,3 с 0,15 M NaCl (PBS) и помещали на 0,5 ч на встряхиватель. В части лунок планшеты по аналогичной методике вместо антител к ОВА иммобилизировали нормальный гамма-глобулин кролика. Окончательно лунки планшет троекратно отмывали PBS с 0,1% по объёму Твин-20 «Analytical grade» (Твин-PBS).

Приготовление стандарта ОВА. Навеску 3-5 мг пятикратно кристаллизованного ОВА взвешивали на аналитических весах с точностью ±0,1 мг. Белок помещали в пенициллиновый флакон и добавляли PBS из расчета, чтобы концентрация белка составила 1 мг/мл. В коническую пробирку

автоматической пипеткой вносили 0,99 мл PBS c 1% по объёму нормальной лошадиной сывороткой (НЛС-PBS) и 0,01 мл раствора ОВА. Раствор перемешивали, отбирали аликвоту 0,025 мл и переносили в пробирку с 0,975 мл нормальной крысиной сыворотки. Полученный раствор титровали в серии двоичных разведений с помощью полуавтоматической пипетки в ряду из 10 пробирок в нормальной крысиной сыворотке. При этом концентрация ОВА в растворах стандарта составляла от 0,5 до 250 нг/мл.

После отмывки от блокирующего реагента в лунки планшеты, сенсибилизированные антителами к ОВА, вносили в 2 повторах следующие растворы в объеме 0,1 мл: 1) бланк раствора (0 нг/мл ОВА) в нормальной крысиной сыворотке; 2) стандартные растворы ОВА в последовательности от S1 (0,5 нг/мл) до S10 (250 нг/мл) в двух повторах; 3) исследуемые пробы сыворотки крыс в двух повторах (также в лунки, сенсибилизированные нормальным гамма- глобулином кролика); 4) раствор яичного белка, которым кормили животных в день забоя, в разведении 1:2 000 000 в нормальной крысиной сыворотке.

Планшету инкубировали 2 часа на встряхивателе при комнатной температуре, после этого лунки отмывали 4-кратно Твин-PBS и вносили моноспецифические кроличьи антитела к ОВА, меченные пероксидазой, в НЛС- PBS в экспериментально подобранном разведении (от 1:2000 до 1:8000 для различных серий препарата). Инкубацию и отмывку повторяли, после чего активность пероксидазы в лунках выявляли по реакции с 0,04% о- фенилендиамином и 0,04% Н2О2 в 0,1 М Na-цитратно-фосфатном буфере рН 6,0. Реакцию останавливали через 10 минут добавлением равного (0,1 мл) объема 1 Н H₂SO₄и фотометрировали планшету на автоматическом иммуноферментном анализаторе «ЭФОС 9305» (Россия) по двухволновой схеме (λ₁=492 нм; Х₂=б20 нм). Для каждого образца сыворотки рассчитывали связывание В_п= (D₁ + D₂)∕2 - (NSB1 - NSB2)∕2, где D - оптическая плотность в лунке образца,

сенсибилизированной антителами к ОВА, в двух повторах, NSB - оптическая плотность в лунке образца, сенсибилизированной нормальным гамма-глобулином кролика, в двух повторах. По стандартному графику для каждого значения

находили концентрацию ОВА в пробе, в нг/мл. В случае если эта концентрация оказывалась ниже 0,5 нг/мл, результат считался не значимым (ОВА не обнаружен). В случае, если концентрация ОВА превышала 500 нг/мл, пробу разбавляли в 10 раз нормальной крысиной сывороткой и анализ повторяли. Величину всасывания ОВА в % от скормленной дозы в расчёте на весь кровоток рассчитывали, исходя из предположения, что масса крови крысы составляет 6% от массы тела [7]при гематокрите около 50% и что проникновением ОВА в эритроциты можно пренебречь.

Метрологические характеристики теста. Чувствительность метода составляла 0,5 нг/мл; тест на открытие 92%, коэффициент корреляции для параллельных проб в пределах одного анализа составил +0,983, коэффициент вариации для одного анализа - 28%, а для разных анализов (по разным стандартным кривым) 39%.

3.8