Метод изучения биораспределения фуллерена Сбо по органам и тканям животных с использованием ВЭЖХ

Экстракцию немодифицированного фуллерена С60 из гомогенатов проводили согласно [133]с некоторыми модификациями. Для этого из исследуемых образцов при комнатной температуре на один объем образца добавляли 2,25 объема ледяной уксусной кислоты Х.Ч., смесь интенсивно перемешивали на персональном вортексе при 3000 об/мин и помещали на 30 мин в ультразвуковую ванну с мощностью генератора 200 Вт, с рабочей частотой 35 кГц и удельной звуковой мощностью 20 Вт*дм^-3.

Количественное определение фуллерена C60 проводили согласно [61, 113]с использованием системы ВЭЖХ Agilent 1200 на колонке «ZORBAX C18». Оптическую плотность регистрировали при длине волны 340 нм. Пик фуллерена идентифицировали по его УФ-спектру, количественное определение проводили по предварительно полученному стандартному графику. Объем наносимого на колонку образца составлял 10, 50 и 100 мкл. Использовали изократическую элюцию подвижной фазой с соотношением толуол:ацетонитрил - 55:45. Скорость потока подвижной фазы составляла 1 мл/мин. В таких условиях время удерживания немодифицированного фуллерена C60 составляет от 7,5 до 8,0 минут, при времени выхода растворителя от 1,8 до 2,0 мин. Точность калибровки проверяли как минимум по одному стандартному образцу перед каждым циклом измерений.

Для построения стандартного графика были приготовлены растворы фуллерена в толуоле следующих концентраций: 0,1 мг/мл, 0,075 мг/мл, 0,05 мг/мл, 0,02 мг/мл, 0,01 мг/мл, 0,005 мг/мл, 0,002 мг/мл, 0,001 мг/мл, 0,0005 мг/мл, 0,0002 мг/мл, 0,0001 мг/мл. Объем вводимого стандартного образца составлял 10 мкл.

Согласно МР 1.2.2641-10 «Определение приоритетных видов наноматериалов в объектах окружающей среды, живых организмах и пищевых продуктах», использованный в данной работе ВЭЖХ-метод анализа фуллерена C₆₀в биологических образцах характеризуется точностью определения ±16 %, полнота извлечения составляет не менее 80%. Минимальное определяемое количество составило 0,001 мкг/мл биологического образца. Как видно из представленных данных, стандартный график, полученный в интервале концентраций фуллерена от 1 до 10 нг/10 мкл является нелинейным с «изломом» в окрестности концентрации 5 нг/10 мкл. Имеет место, таким образом, кажущееся отклонение от закона Ламберта-Бера, связанное, как можно предположить, с образованием при концентрации более 5 нг/10 мкл мультимолекулярных агрегатов (мицелл) фуллерена в подвижной фазе, имеющих меньший

коэффициент экстинкции при выбранной длине волны, чем истинный (молекулярный) раствор фуллерена, стабильный при меньших концентрациях. Для высоких концентраций фуллерена Сб0 (от 20 и до 1000 нг в образце) стандартный график является линейным, то есть закон Ламберта-Бера в точности соблюдается.

Рисунок 3. Калибровочный график фуллерена в толуоле с концентрацией фуллерена от 0,1 мг/мл до 0,002 мг/мл. Построение графика методом наименьших квадратов (линейная регрессия)

Рисунок 4. Калибровочный график фуллерена в толуоле с концентрацией фуллерена от 0,001 мг/ мл до 0,0001 мг/мл

3.9