Физиологические и биохимические аспекты биосинтеза авермектинов

Основными факторами, влияющими на биосинтез и содержание отдельных компонентов, явля­ются количественное соотношение источников углерода и азота (C/N) в питательной среде и дос­тупность источника углерода.

Доступность источника углерода определяется концентрацией его в среде, интенсивностью пог­лощения и характером внутриклеточного катаболизма под влиянием различных факторов, в том числе и азотного обмена.

В культуре штамма S. avermitilis МА-4990 (изолята штамма АТСС 31271) максимальная общая продуктивность наблюдалась при C/N = 20. Однако относительное содержание авермектинов группы В увеличивалось и при дальнейшем повышении величины C/N вплоть до 32. В свою оче­редь, повышение концентрации азотсодержащих субстратов в среде, ведущее к снижению C/N, вызывало снижение общей продуктивности культур и относительного содержания авермектинов группы В.

При концентрациях сульфата аммония в синтетической среде в пределах 0,05-0,2 % соотноше­ние авермектинов групп В и А (В/A) относительно постоянно и составляет 1,0-1,2. При дальней­шем увеличении содержания соли аммония до 0,3-0,5 % биосинтез авермектинов В заметно подав­лялся и величина В/A становилась ниже 0,5. В культуре мутанта S. avermitilis 10/51 (получен в России), производного от штамма АТСС 31271, отмечалось аналогичное подавление образования авермектинов В при повышении концентрации хлористого аммония в синтетической среде: отно­сительное содержание авермектинов В при 0,04, 0,1 и 0,2 % NH₄C1 составляло 50, 36, 22 %, соот­ветственно. Изменение концентрации аммония не влияло на соотношение авермектинов групп «1» и «2».

Различия в составе синтезируемых авермектинов выявились также при использовании в качес­тве единственных источников азота в составе синтетических сред отдельных аминокислот. Наибо­лее высокая величина В/A наблюдалась с глицином, лизином и изолейцином; а наименьшая — с глутаминовой кислотой и метионином.

Особый интерес представляет изучение влияния на продуктивность культур S. avermitilis аминокислот, участвующих в биосинтезе авермектинов. К таковым относятся валин, изолей­цин и треонин, являющиеся предшественниками изобутирата или 2-метилбутирата, и мети­онин — предшественник S-аденозилметионина, метилирующего гидроксильные радикалы в по­ложении С-3 в олеандрозах и ОН-радикал в положении С-5 в лактоне авермектинов группы А (см. рис.1). 5-С-метилтрансфераза, отличная от метилтрансферазы сахарной части антибиоти­ка, трансформирует авермектины В в авермектины А. При наличии в составе комплексной среды дополнительных количеств метионина или валина (по 0,1 %) величина В/A была ниже, чем в присутствии треонина или изолейцина. В варианте с метионином это объясняется стиму­ляцией 5-С-метилирования авермектинов В. В присутствии аминокислот отмечалось снижение общей продуктивности культур, наиболее выраженное с валином и метионином. Уменьшение продуктивности происходило и в культурах на синтетических средах, содержащих в качестве единственного источника азота валин, изолейцин или треонин. При концентрации изолейцина 0,2 % происходило полное подавление биосинтеза авермектинов. В то же время мутант с нару­шенным усвоением изолейцина в синтетической среде с глюкозой и сульфатом аммония (в при­сутствии изолейцина) синтезировал авермектины, а, следовательно, и 2-метилбутират (предше­ственник авермектинов группы «а») de novo, а не из экзогенного изолейцина. Это указывает, по крайней мере, на слабую ретрорегуляцию изолейцином собственного биосинтеза в клетках про­дуцента.

Таким образом, можно отметить следующую закономерность: при избытке в среде азота в аммо­нийной или/и аминной форме снижаются общая продуктивность культур и относительное содер­жание авермектинов группы В в синтезируемом комплексе.

В производстве авермектинов на стадии биосинтеза необходимо учитывать следующие особен­ности антибиотикообразования в культуре S. avermitilis:

• в продуктивной фазе культивирования интенсивность синтеза авермектинов и липидов прямо пропорциональна;

• авермектины не секретируют в культуральную жидкость, а накапливаются в липидной фракции мицелия;

• глюкоза оказывает относительно слабое репрессирующее действие на биосинтез антиби­отика;

• авермектины, как и липиды, — безазотистые соединения.

Известно, что синтез таких безазотистых соединений как гликоген и липиды в клетках ак­тиномицетов активизируется при лимите азота в среде. При этом значительно увеличивается (относительно количества белка в клетке) содержание триглицеридов, в составе которых жирные кислоты представлены в основном (до 60-80 %) разветвленными жирными кислота­ми. Аналогично в культуре S. avermitilis синтез авермектинов и липидов заметно возрастает после исчерпания источников азота и при наличии глюкозы в культуральной жидкости; в сос­таве липидов преобладают разветвленные жирные кислоты: до 60-70 % от общего содержания жирных кислот.

Складывается впечатление, что пути биосинтеза триглицеридов и авермектинов конкурируют за общие предшественники: уксусную, пропионовую, изо- и 2-метил-масляную кислоты. При фер­ментации в среде, содержащей специфические ингибиторы липидогенеза, угнетался синтез не только липидов, но и авермектинов. Вероятно, что обогащение мицелия липидами, обеспечивая растворение и компартаментализацию антибиотика в липидной фракции, способствует усилению биосинтеза авермектинов.

В свете изложенного выше становится понятной регулирующая роль величины C/N для продуцентов макролидов, в том числе, и авермектинов. При достаточной для накопления макси­мальной биомассы концентрации источника азота в среде наличие источника углерода в культу­ральной жидкости обеспечивает, после исчерпания азота, интенсификацию образования антиби­отика и липидов. Обогащение культуры углеродом может быть осуществлено или увеличением концентрации источника углерода в исходной среде, или внесением источника углерода по ходу ферментации.

Повышение концентрации глюкозы в исходной среде от 4,5 до 7,5 % вызывало увеличение би­омассы в 2-2,5 раза в культуре штамма S. avermitilis МА-4990, но не вело к возрастанию специфичес­кой продуктивности. В контрольной культуре (4,5 % глюкозы) максимальная специфическая про­дуктивность наступала на 6-е сутки ферментации, в культуре с 7,5 % сахара — на 4 суток позднее.

ферментации превышала контрольную на 80 % при отсутствии повышения уровня биомассы. Таким образом, внесение источника углерода в культуру по окончании трофофазы, а, следовательно, и ис черпании азота, привело к значительному увеличению внутриклеточного содержания авермектинов.

Образование авермектинов другим штаммом значительно подавлялось при дополнительном внесении глюкозы (в количестве 30 г/л) после 24 часов ферментации: скорость биосинтеза антиби­отика восстанавливалась лишь к 6-м суткам. В меньшей степени угнетение синтеза авермектинов происходило при добавлении сахара к 3-4-суточным культурам и практически не происходило, ес­ли глюкозу вносили в 5-суточную культуру. В культурах с дополнительно внесенной глюкозой процесс антибиотикообразования пролонгировался, и накопление авермектинов (в варианте с до­бавлением сахара к 5-суточной культуре) достигало максимальной величины 2,0—2,5 г/л после 10 суток ферментации (в контрольной культуре после 7 суток ферментации накопление авермек­тинов составило 0,9-1,2 г/л).

Среди различных изученных субстратов глюкоза оказалась наилучшим источником углерода для биосинтеза авермектинов, так как S. avermitilis, в отличие от большинства других актиноми­цетов, ассимилирует ее относительно медленно.

С целью увеличения компонентов фракции «а», в частности В1а, в синтезируемом комплексе предложено использовать ферментационную среду, содержащую исходно в качестве основного ис­точника углерода крахмал, а по ходу ферментации трижды добавлять глюкозу (по 1 %) после 4, 5 и 6 суток культивирования. Подобная технология производства авермектинов позволила повысить долю компонента В1а в комплексе до 39,3% (против 32,5 % в контроле).

Это увеличение доли компонентов «а» в комплексе можно объяснить лимитацией метаболизма по углероду, так как доступность углерода снижена, с одной стороны, введением в среду медленно утилизируемого углерода — крахмала, с другой, дробной подачей глюкозы в культуру. Увеличе­ние доли компонентов «а», сопровождающееся снижением доли фракции «1» в комплексе, являет­ся следствием лимитирования углеродного источника питания.

Таким образом, оптимальные условия для максимального накопления авермектинов возника­ют при условиях, обеспечивающих быстрый прирост значительного количества биомассы (этот фактор важен, поскольку авермектины накапливаются внутриклеточно) и быстрое истощение источников азота в культуральной жидкости при наличии в ней источника углерода. При этом целесообразно вносить дополнительное количество глюкозы в период снижения концентрации уг­леводов в культуре.

Метаболической причиной изменений композиции авермектинового комплекса являются изме­нения в углеводном обмене актиномицета, которые, в свою очередь, детерминируются дос­тупностью источника углерода. Снижение содержания углевода в среде лимитирует метаболизм клетки по углероду скорее не прямо, но косвенно, так как уменьшает соотношение C/N, вызывая повышение включения углерода в азотсодержащие соединения, а не в безазотистые метаболиты, какими являются авермектины.

Именно определенным лимитом углерода можно объяснить повышение доли компонентов А в комплексе при снижении концентрации глюкозы в среде. Снижение концентрации глюкозы ведет к заметному увеличению фракции А за счет повышения степени метилирования компонентов В. Подобный эффект можно объяснить лимитированием образования сахарной части авермектинов, которое вызывает на фоне ослабления активности процессов гликозилирования агликонов интен­сификацию реакций метилирования агликонов и моносахаридов авермектинов.

Доступность источника углерода оказывает влияние и на содержание компонентов «а» и «Ь» в комплексе. Известно, что одной из ключевых реакций в биосинтезе 2-кето-З-метилвалериано- вой кислоты (предшественник стартовой единицы компонентов «а») является конденсация 2-ке- томасляной кислоты и пировиноградной кислоты.

5.