Выделение РНК (задача 1)

Качество выделения суммарной РНК является одним из ключевых элементов, обусловливающих успешность работы по клонированию полноразмерных кДНК. Качественная суммарная РНК позволяет осуществить клонирование полноразмерных кДНК генов без дополнительного выделения поли(А) + фракции мРНК.

Для выделения суммарной РНК могут быть использованы различные коммерчески доступные наборы реактивов, например,

Trizol (GIBCO/Life Technologies), TRI Reagent (Ambion) или RNeasy

kits (QIAGEN). В рамках настоящего практикума предлагается модифицированный метод гуанидин тиоцианат-фенол- хлороформной экстракции (Chomczynski & Sacchi, 1987) с использованием TRI реагента (Ambion).

Для выделения РНК лучше использовать свежие ткани. Если это невозможно, применяют различные методы фиксации тканей для хранения. Ткань можно быстро заморозить в жидком азоте и хранить при -70°С. В полевых условиях можно зафиксировать ткани в фиксаторе тканей RNA-Later (Ambion). Помещенный в RNA-Later кусочек ткани может храниться при комнатной температуре или на +4°С в течение несколько месяцев, после чего из него всё ещё можно получить высококачественную РНК.

Внимание! Образец, предназначенный для фиксации, должен иметь небольшой (не более 5 мм в диаметре) объем, чтобы обеспечить моментальное замораживание или проникновение фиксатора внутрь живой ткани. В противном случае в момент фиксации ткани может произойти деградация РНК под действием РНКаз, присутствующих в любой живой клетке.

Большинство тканей легко растворяются в лизирующем буфере для выделения РНК с помощью пипетирования. Однако если ткани содержат нерастворимые частицы (например, минеральный скелет, хитин и т.д.), для разрушения тканей может потребоваться гомогенизатор (пестик для гомогенизации в микропробирке). Для того чтобы избежать деградации РНК, ткань следует гомогенизировать как можно быстрее и тщательнее.

2.2.