Оценка качества суммарной РНК (задача 1)

Качество полученной РНК можно оценить с помощью формальдегидного гель-электрофореза в денатурирующих условиях (Sambrook et al., 1989). Для экспресс-анализа удобнее воспользоваться неденатурирующим гель-электрофорезом в агарозе (ТАЕ-буфер) с окрашиванием бромистым этидием.

Качество РНК оценивают по соотношению интенсивности полос, соответствующих 18S и 28S рРНК. При хорошем качестве выделенной РНК соотношение интенсивности полос 18S и 28S должно быть не менее 1:1. Изменение соотношения в пользу 18S РНК свидетельствует о частичной деградации образца. Следует сказать, что у ряда беспозвоночных видна только одна полоса рРНК на уровне 18S (Ishikawa, 1977). У некоторых организмов, например у простейших, рРНК сегментирована; в этом случае суммарная РНК выглядит как шмер в области 2-3 т.п.о.

Если РНК имеет длину меньше ожидаемой или выглядит деградированной по данным электрофореза, необходимо проверить чистоту и качество реагентов для выделения РНК и повторить выделение. Частично деградированная РНК (образцы тканей, подвергнутые жестким воздействиям, или из тканей больных) иногда используется для синтеза кДНК, в частности когда нет возможности повторно провести выделение РНК. Однако следует иметь в виду, что количество полноразмерных последовательностей кДНК в таком образце снижено. Особенно это относится к протяженным молекулам.

Препарат суммарной РНК часто содержит примесь геномной ДНК, которая на гель-электрофорезе выглядит как высокомолекулярный шмер (или полосы). Как правило, примесь геномной ДНК не влияет на качество синтеза кДНК с использованием олиго(ЭТ)-содержащего праймера (см. раздел 2.3).

Значительный избыток геномной ДНК может быть удален переосаждением 12М LiCl.

Внимание! В некоторых протоколах рекомендуется избавляться от фракции геномной ДНК с помощью обработки препарата ДНКазами или дополнительной экстракцией кислым фенолом, которая приводит к частичной деградации ДНК, но сохраняет РНК. Однако образование коротких фрагментов при частичной деградации геномной ДНК может привести к возникновению неспецифичных продуктов реакции синтеза, так как эти короткие фрагменты могут выступать в качестве неспецифичной затравки для РНК-зависимой ДНК полимеразы.

2.3.