Синтез кДНК на матрице суммарной РНК (задача 2)
Для синтеза протяженных (полноразмерных) молекул кДНК обычно используют РНК-зависимую ДНК полимеразу (обратную транскриптазу) M-MLV (murine moloney leukemia virus) и ее мутантные формы с уменьшенной или уничтоженной активностью РНКазы H (данная активность осуществляет разрезание последовательность РНК в гетеродуплексе ДНК-РНК, оставляя ДНК в однонитевой форме).
Другие полимеразы, используемые для различных протоколов синтеза первой цепи, такие как обратная транскриптаза AMV (avian moloney virus) и Tth-полимераза, менее процессивны и обладают меньшей точностью.
Для инициации реакции обратные транскриптазы нуждаются в ДНК-затравке, комплементарно отжигающейся на РНК-матрице. В зависимости от поставленной задачи, затравкой может выступать ген-специфичный праймер, случайный праймер (random primer) или олиго-(йТ) праймер. Использование олиго-(йТ) праймера, способного отжигаться на поли(А) «хвост» мРНК, позволяет обогатить образец кДНК транскрибируемыми
последовательностями, представленность которых по сравнению с пулом рРНК и тРНК весьма низка.
Среди разнообразных протоколов приготовления двухцепочечной (дц) кДНК метод синтеза кДНК со сменой матрицы (template switching cDNA synthesis) является наиболее эффективным и простым в использовании (рис. 2.1). Этот метод реализован в наборе реактивов Mint cDNA synthesis kit, входящем в Набор для практикума (Евроген).
Указанный метод основан на способности обратной транскриптазы MINT (модифицированная MMLV ревертаза, РНКаза H минус) по достижению конца РНК-матрицы нематрично добавлять на 3'-конец новосинтезированной цепи кДНК несколько нуклеотидных остатков, преимущественно dC (Matz et al., 1999;
Schmidt & Mueller, 1999).
Синтез первой цепи кДНК на РНК-матрице осуществляется на матрице РНК с праймера, состоящего из олиго-(dT) последовательности и «внешней» адаптерной последовательности (3'-праймер). По окончании матричного синтеза обратная транскриптаза добавляет несколько нуклеотидов dC на конец первой цепи.
Образующаяся первая цепь кДНК, таким образом, содержит последовательность 3' -праймера на 5’-конце и олиго^С) последовательность на 3'-конце. Эта олиго^С) последовательность служит местом отжига олигонуклеотидного адаптера (PlugOligo), имеющего комплементарную олиго^С) последовательность на 3'- конце. Обратная транскриптаза воспринимает PlugOligo как продолжение РНК матрицы и продолжает синтез первой цепи. Таким образом, первая цепь кДНК оказывается фланкирована с одной стороны последовательностью 3'- праймера, а с другой - последовательностью, комплементарной PlugOligo. 3'-конец PlugOligo адаптера заблокирован, что предотвращает его участие в реакции как неспецифического праймера.Двухцепочечную кДНК амплифицируют в ПЦР с универсальным праймером М1, соответствующим внешней части PlugOligo и 3'-праймера. Для этого используют ДНК-полимеразы, адаптированные для амплификации длинных фрагментов ДНК (например, Encyclo полимераза, Евроген), которые позволяют получать дц-кДНК, обогащенную полноразмерными
последовательностями. (Более подробно реакция синтеза кДНК описана в методической разработке Mint)
Внимание! Под полноразмерной последовательностью понимают полную нуклеотидную последовательность мРНК, включающую, кроме кодирующей последовательности,
Рис. 2.1. Схема синтеза кДНК со сменой матрицы с помощью набора реактивов Mint. Прямоугольниками обозначены праймеры, адаптеры и комплементарные им последовательности
2.1.
Еще по теме Синтез кДНК на матрице суммарной РНК (задача 2):
- Оценка качества суммарной РНК (задача 1)
- Задача 1. Выделение суммарной РНК
- Задача 2. Синтез первой цепи и амплификация двухцепочечной кДНК
- Протокол Синтез первой цепи кДНК
- Выделение РНК (задача 1)
- Ингибиторы синтеза белка, не образующие аддукты ДНК и РНК
- Ингибиторы синтеза белка и клеточного деления, образующие аддукты ДНК и РНК.
- Гидролиз микробных полинуклеотидов (РНК) с получением продуктов технического и пищевого назначения и субстанций для синтеза лекарственных средств
- Билет 42.Прогрессивные матрицы Дж. Равена.
- 2. Разработка пористых матриц-носителей с использованием сверхкритических флюидных технологий
- Амплификация 3'-концевых фрагментов кДНК, 3'- RACE
- Амплификация дц-кДНК