Теоретическая часть

В ряде случаев перед исследователем - молекулярным биологом - возникает задача по идентификации и исследованию гена, ответственного за определенный фенотипический признак. При этом, как правило, исследователь располагает лишь ограниченной информацией о структуре соответствующего гена, например данными о нуклеотидной или аминокислотной последовательности фрагмента, или структуре гомологичных белков из других организмов.

В этих случаях, исследование может включать следующие основные этапы:

1) выявление фрагмента целевого гена и определение его точной нуклеотидной последовательности (если такой фрагмент неизвестен);

2) выявление 3'- и 5'-концевых последовательностей транскрипта (RACE);

3) клонирование полной кодирующей последовательности гена;

4) создание конструкции для экспрессии целевого гена в бактериальной системе экспрессии;

5) выделение рекомбинантного белка и исследование его активности (подтверждение связи между клонированным геном и фенотипическим признаком).

Целевые нуклеотидные последовательности могут быть клонированы из образцов геномной ДНК. Однако низкое процентное содержание кодирующих последовательностей в геноме и присутствие разбивающих их интронов существенно затрудняют работу. Гораздо более эффективно использовать для выявления кодирующих последовательностей гена образцы так называемой комплементарной ДНК (кДНК). кДНК синтезируют на матрице - лишенной интронов зрелой РНК, - с помощью вирусных РНК -зависимых ДНК полимераз (ревертаз, обратных транскриптаз). Последовательность молекулы кДНК полностью комплементарна последовательности соответствующей РНК и содержит всю необходимую информацию о кодирующей последовательности целевого гена.

Таким образом, работу по клонированию целевых фрагментов гена обычно предваряют стадии выделения РНК и синтеза кДНК.

2.1.