Технологии получения дрожжевой РНК

Промышленное производство РНК из дрожжей основано на применении метода экстракции из нативных или высушенных клеток. Сложность выделения РНК из биомассы состоит в том. что она в клетке связана в комплекс с белками и образует так называемый белково-нуклеиновый комплекс

Рис.

1, 10,12, 14 — реактор; 2,11, 13, 15 — путч-фильтр; 3, 4, 6, 9, 17,19,20 — сборник; 5 — ультрафильтрационная установка; 7 — вакуум-выпарная установка; 8 — распылительная сушилка; 16 — вакуум-сушительный шкаф;

18 —ректификационная колонна

(БНК), или нуклеопротеид, в виде которого она и переходит в раствор экстракта. При получении РНК нуклеопротеид должен быть разрушен химическими или энзиматическими методами. Наибо­лее часто используют разбавленные растворы гидроксидов аммония или натрия. Для этого в реак­торе 1 (рис. 7) проводят щелочную экстракцию РНК при концентрации клеток дрожжей в суспен­зии не более 8-10 %, pH 8,5—9,0 и температуре 80—90 °С в течение 45—60 мин. При этом в жидкую фазу переходит БНК, содержащий 50-70 мае. % полирибонуклеотидов.

После экстракции суспензию направляют на рамный фильтр-пресс 2, отжимают дрожжевой шлам, который собирают в сборник 3 и используют в дальнейшем для получения белковых про­дуктов. Фильтрат, собранный в сборник 4, направляют на извлечение. Выделить БНК наиболее просто осаждением в изоэлектрической точке (ИЭТ) нуклеиновых кислот (1,8-2,0). Однако кон­центрация нуклеиновых кислот в растворе относительно невелика (8—10 г/л), а степень их осаж­дения в ИЭТ зависит от начальной концентрации. Чтобы повысить значение последней можно формально перерабатывать более концентрированные суспензии на стадии экстракции, но тогда большая часть нуклеопротеидов останется в дрожжевом шламе и выход продукта будет низким.

Для повышения выхода нуклеиновых кислот бесклеточный фильтрат подвергают ультракон­центрированию, т.е. раствор из сборника 4 поступает на ультрафильтрационную установку 5, где раствор высокомолекулярных фракций концентрируют в несколько раз и очищают от низко­молекулярных продуктов, отходящих с пермеатом. Последний содержит пептиды, аминокис­лоты, витамины. Обычно его собирают в сборник 6, откуда направляют на вакуум-выпарную ус­тановку 7, где упаривают до содержания сухих веществ 20 % и высушивают распылением в то­ке горячего воздуха в сушилке 8. В результате получают готовый продукт — дрожжевой эк­стракт очищенный (ДЭ), который может быть использован в бактериологии как азотсодержащая основа питательных сред.

Ретант из сборника 9 передается в реактор 10, где проводят изоэлектрическое осаждение нукле­опротеидов. Для этого раствор сначала охлаждают до 4-6 °С, добавляют НС1 или Н₃РО₄ до значения показателя pH среды 1,0-2,0. Нуклеиновые кислоты с выходом не ниже 80 % переходят в осадок. Последний отделяют на фильтре 11, кислый фильтрат может быть объединен с пермеатом и в даль­нейшем переработан в указанный выше дрожжевой экстракт. Образующийся осадок нуклеопроте­идов направляют на стадию получения очищенной технической РНК.

Для очистки нуклеиновых кислот от белков обычно используют дешевые протеазы, не облада­ющие заметной РНК-азной активностью. В качестве таковых применяются коммерческие техни­ческие препараты щелочной или нейтральной протеазы микробного происхождения или панкре­атин. Для этого в реакторе 12 осадок нуклеопротеидов растворяют в воде до 7,5 %-ной концентра­ции при температуре 40-42 °С. После этого добавляют в необходимом количестве фермент. Гидролиз ведут 4 ч, после чего инактивируют протеазу путем прогрева суспензии до 80—90 °С. От взвешенных частиц раствор очищают фильтрованием на фильтре 13 с намывным слоем. Полученный раствор по- лирибонуклеотидов поступает в реактор-осадитель 14, где РНК осаждают из раствора добавлением одного объема кислого этанола на один объем передела.

Все водно-спиртовые стоки собирают в сборник 17, откуда они поступают на регенерацию в аппа­рат 18. Кубовый остаток из сборника 20 обычно используют как субстрат для биосинтеза дрожжей.

Более часто, чем РНК в медицине применяется натриевая соль — нуклеинат натрия, которая об­ладает большей устойчивостью при хранении.

Нуклеинат натрия можно получить из осветленного раствора РНК. Для этого в реакторе 14 в ра­створе с помощью гидроксида натрия устанавливают значение pH около 9,0 и добавляют 10-кратный объем этанола. Осаждение происходит за счет пониженной растворимости нуклеината в спирте. Образующийся осадок натриевой соли РНК промывают чистым этанолом и высушивают под вакуумом.

Очистку нуклеопротеидов от белка можно проводить, не применяя технические протеазы, а ис­пользуя ортофосфаты аммония, являющиеся макроэлементами питания при биосинтезе кормовых дрожжей. Известно, что полифосфаты и ортофосфаты способны образовывать малорастворимые комплексы с белками по обменной реакции с нуклеопротеидами. Тогда технологию очистки нук­леиновых кислот от белков можно свести к указанному выше типу взаимодействия. Образующиеся при этом фосфаты белков могут быть легко отделены фильтрованием и в дальнейшем утилизиро­ваны на стадии получения кормовой биомассы.

Однако полифосфаты медленно усваиваются микроорганизмами, что затрудняет утилизацию промышленных стоков в основном производстве или на станциях (цехах) биологической очистки. Поэтому было предложено заменить полифосфаты на кислые ортофосфаты аммония.

С использованием ортофосфатов можно предложить два варианта технологических схем полу­чения очищенной РНК.

Первая из них представлена на рис. 8. В реакторе 1 готовят 10—12 % -ную суспензию дрожжей в 1,5 М растворе диаммонийфосфата. Экстракцию РНК проводят при температуре 80-90 °С, pH 8,5, создаваемом гидроксидом аммония.

Рис. 8. Технологическая схема получения полинуклеотидов из нуклеопротеидов:

1,8 — реактор: 2 — генератор; 3. 4. 6. 7. ! 1 — сборник; 5 — ультрафильтрационная установка; 9 — нутч-фильтр; 10 — сушильный шкаф

408 Часть II. Примеры применения биотехнологии ВАВ в науке и нроизиолстне

Далее получают осветленный экстракт, отделяя суспензию денуклеинизированных клеток се­парированием на сепараторе 2 или фильтрованием. Денуклеинизированную биомассу собирают в сборнике 3. Поскольку она содержит большое количество соли, то ее последующая переработка должна предусматривать стадию промывки.

По другому способу такую биомассу можно разбавить водой и вернуть на стадию сепарации мик­робных клеток в производстве кормового белка. Технико-экономические показатели производства улучшаются, если солевые экстракты полирибонуклеотидов подвергают ультрафильтрации. В ре- танте концентрируется РНК, а образующиеся солевые пермеаты в качестве экстрагента повторно используют для обработки микробных суспензий.

Солевой экстракт из емкости 4 пропускают через ультрафильтрационную установку 5 до соот­ношения объемов пермеата к ретанту 4:1. Ретант из сборника 6 направляют на стадию осаждения РНК в ИЭТ, а пермеат из сборника 7 поступает на стадию концентрирования солевого раствора 2- кратным упариванием.

Полученный концентрат используют для приготовления экстрагента. Таким образом может быть создан замкнутый цикл использования соли.

Осаждение РНК в ИЭТ осуществляют в реакторе 8 при температуре 4-6 °С и значении pH среды 1,8-2,0, создаваемом добавлением концентриро-ванной соляной кислоты. Количество вносимой кислоты составляет примерно 20 об. % от холодного ретанта. Время осаждения полирибонукле­отидов не превышает 2 ч. РНК выпадает в виде вязкой липкой массы. Поэтому реактор 8 снабжен боковым штуцером для декантирования кислого надосадка, который может быть утилизирован в отделении приготовления питательных сред для культивирования кормовых дрожжей.

Выход РНК по такой технологии относительно высокий и составляет до 3 % от сухих веществ или 30 % от содержания нуклеиновых кислот в микробных клетках.

Данная технология обладает меньшим числом переделов и позволяет получать РНК с высоким выходом. Однако ее отличают повышенные энергозатраты, связанные с регенерацией экстрагента. Она имеет перспективу при организации многотоннажного производства мощностью до несколь­ких тонн РНК в год.

В крупнотоннажном производстве целесообразно использовать несколько иную схему перера­ботки экстрактов нуклеиновых кислот, исключающую, с одной стороны, применение протеолити­ческих ферментов, а с другой, — использующую ортофосфаты при очистке нуклеиновых кислот от белковой примеси.

Технологическая схема такого производства представлена на рис. 9. В реакторе 1 проводят эк­стракцию РНК водным раствором аммиака так же, как и в вышеуказанном случае. Денуклеинизи­рованную биомассу отделяют на сепараторе 3 и собирают в сборнике 4. В дальнейшем ее перера­батывают в белковые продукты. Бесклеточный экстракт, собранный в сборнике 5, передается на ультрафильтрационную установку 6. Образующийся пермеат, собранный в сборнике 7, перера­батывают в готовый продукт — дрожжевой экстракт, используя для этого промежуточный сбор­ник 9, вакуум-выпарную установку 8 и распылительную сушилку 10.

Ретант из сборника 5 передают в реактор 11 для осаждения нуклеопротеидов в ИЭТ.

Солевой раствор РНК собирают в реакторе-осадителе 17, где проводят осаждение очищенных поли­нуклеотидов в ИЭТ при вышеуказанных условиях. Надосадочную жидкость декантируют, а РНК очи­щают переосаждением из кислого спирта. Спиртовый осадок РНК отделяют на фильтре 18, отрабо­танные спиртсодержащие растворы собирают в сборнике 19, и далее они поступают в ректификацион-

Рис. 9. Технологическая схема получения полинуклеотидов из нуклеопротеидов с использованием солей ортофосфорной кислоты: 1, 11,14,17 — реактор; 2, 4, 5, 7, 9, 13, 16, 19, 21, 22 — сборник; 3 — сепаратор;

6 — ультрафильтрационная установка; 8 — вакуум-выпарная установка; 10 — распылительная сушилка;

12, 15, 18 — кутч-филыпр; 20 — ректификационная колонна; 23 — вакуум-сушилъный шкаф

ную колонну 20. Регенерированный этанол собирают в сборнике 21 и повторно используют. Кубовый остаток из сборника 22 передают на приготовление субстрата для биосинтеза кормового продукта.

Сырой осадок РНК на фильтре 18 промывают этанолом и высушивают на пневматической су­шилке 23. Готовый продукт содержит не менее 80 % основного вещества.

Дрожжевая РНК находит применение в медицине при производстве фармакопейного препара­та — нуклеината натрия как иммуномодулятора широкого спектра действия или панкреатическо­го гидролизата РНК, являющегося субстанцией для производства инъекционного препарата, ши­роко используемого в лечении тапеторетинальных заболеваний глаз.

С наибольшей перспективой РНК рассматривают как полупродукт для получения пищевку­совых добавок и лекарственных средств нуклеотидной природы. Используемые для этого техноло­гии основываются на химическом или энзиматическом гидролизе полирибонуклеотидов.

Указанные выше технологии в равной мере применимы в отношении выделения липидов и по­лирибонуклеотидов из биомассы любых промышленных микроорганизмов (дрожжей и бактерий). Нет принципиальных различий и в части последующей переработки РНК, выделенных из раз­личных микробных клеток.

3.2.