1.4. Определение полного размера CpG-островка гена /ЗА-адаптина.

Для последующего исследования мы выбрали CpG-островок гена вЗА-адаптина, так как он оказался единственным выявленным CpG-островком, ассоциированным с известным геном. В связи с этим возникла задача установить полную длину CpG-островка.

А. ДНК

Клонирование и секвенирование продукта ПЦР

Б.

26-11 ► ►26-5

..................................................

-426-12 -426-10 -426-8 426-2

Рисунок 13. Схематическое изображение варианта метода "прогулка по геному". А. Схема опыта; EZI - известная последовательность, ■ ■ ■ ■ - неизвестная последовательность, ► - праймер. Б. Расположение использованных для клонирования праймеров к известной последовательности 5' области гена /ЗА-адаптина.

Для получения и исследования неизвестной 5' области гена мы применяли гнездовую ПЦР с использованием двух пар инвертированных праймеров (рис. 13Б). Первоначально кольцевую ДНК амплифицировали с использованием праймеров 26-11 и 26-8. Затем проводили второй раунд ПЦР, где применяли праймеры 26-5 и 26-10. При этом в качестве матрицы использовали реакционную смесь после первого ПЦР, как в неразведенном виде, так и в разведении 1:10. На рисунке 14А представлены результаты

Рисунок 14. Анализ фрагментов ДНК, полученных с помощью инвертированных праймеров к гену рЗА-адаптину. А. Результат электрофореза в агарозном геле продуктов второго раунда ПЦР; М - маркер X PstI. Б. Гибридизация продуктов второго раунда ПЦР с радиоактивномеченным праймером 26-2. Разведение матрицы - продукта первого раунда ПЦР: 1 - неразведенный, 2 - разведение 1:10. Стрелкой указан исследуемый фрагмент. Числами справа указаны размеры маркерных фрагментов.

электрофореза в агарозном геле продуктов амплификации после второго раунда ПЦР. Видно, что в геле присутствовало несколько полос. Для выявления продукта ПЦР, содержащего необходимую нам последовательность, мы переносили амплификаты на нитроцеллюлозную мембрану и гибридизовали с радиоактивно-меченным праймером 26-2, последовательность которого должна присутствовать в продукте ПЦР, содержащем известную область гена вЗА-адаптина. Результаты гибридизации показаны на рисунке 14Б. Оказалось, что продукт с размером 1966 п.н. и является искомым. Он был клонирован и секвенирован.

Рисунок 15.

динуклеотидов и расположение CpG островка. — - CpG островок, ? - повтор, И -экзон, ЕЕ - интрон, ЕЕ - вновь клонированная последовательность. Вертикальная черта

обозначает единичный CpG динуклеотид.

В результате этой работы мы определили 5' нетранскрибируюмую последовательность гена (ЗЗА-адаптина размером 597 п.н. Анализ объединенной последовательности 5' области гена (идентификационный номер в GenBank - AF247736.2) позволил определить размер его CpG-островка, который составил 868 п.н. (рис. 15). Он включает в себя 56 CpG динуклеотидов и имеет следующие характеристики: значение параметра Н/Т равно 0.74, GC состав - 0.60. Наибольшая плотность CpG динуклеотидов (24 из 56) и сайтов МЧР (13 из 20) наблюдается в 5' нетранскрибируемой зоне размером 238 п.н., непосредственно примыкающей к первому экзону. Наличие и положение Alu-повтора, ограничивающего CpG-островок с 5' стороны, было определено по представленной позднее в базах данных нуклеотидной последовательности этого района хромосомы 5.

Таким образом, мы установили полный размер и последовательность CpG-островка гена /ЗЗА-адаптина, который располагается в 5' области гена и включает в себя нетранскрибируемый район, первый экзон и начало первого интрона. При этом он является CpG-островком, как по общепринятым критериям, так и по более жестким критериям (см. выше).