Протокол Синтез первой цепи кДНК

Внимание! Для достижения наилучшего результата

рекомендуется использовать 1 - 2 мкг суммарной РНК на реакцию синтеза. Качество синтезированной кДНК зависит от качества РНК, использованной в качестве матрицы.

Для инкубации реакционной смеси используйте ПЦР- амплификатор.

Некоторые процедуры, описанные в протоколе, должны быть

выполнены одновременно. Внимательно прочитайте протокол

перед началом работы!

1. Прогрейте образцы РНК при 65°C в течение 1-2 мин и перемешайте встряхиванием для дезагрегации РНК. Сбросьте капли со стенок пробирки на настольной центрифуге.

Внимание! В качестве положительного контроля используйте 2 мкл контрольной РНК C/avu/aria.

2. Для каждого образца РНК приготовьте первую часть реакционной смеси (в пробирке на 0,2 мл или 0,5 мл), добавляя реагенты в указанном порядке:

1 - 3 мкл Раствор РНК (1-2 мкг РНК);

1 мкл 3'-праймер (10 мкМ);

1 мкл PlugOligo олигонуклеотид (1 5 мкМ).

Доведите объем реакционной смеси до 5 мкл, добавив стерильную воду

3. Аккуратно перемешайте компоненты реакционной смеси пипетированием, сбросьте капли со стенок пробирки на настольной центрифуге.

4. Если амплификатор не имеет нагревающейся крышки, добавьте каплю минерального масла в каждую пробирку для предотвращения испарения реакционной смеси. Закройте пробирки и поместите их в амплификатор.

5. Инкубируйте пробирки при 70°C в течение 2 мин (используйте нагревающуюся крышку, если это возможно). По истечении этого времени снизьте температуру инкубации до 42°C, не вынимая пробирки из амплификатора. Продолжайте инкубацию при 42°C не менее 1, но не более 5 мин, пока не будет готова вторая часть реакционной смеси (см. п. 6).

Внимание! Вторую часть реакционной смеси добавляют при температуре 42°C. При более высоких температурах может произойти инактивация обратной транскриптазы.

6. Во время инкубации, описанной в п.

2 мкл 5х буфер для синтеза первой цепи кДНК

(First-strand buffer)

Внимание! При одновременной постановке нескольких реакций, приготовьте общую реакционную смесь, пересчитав количества компонентов реакции.

7. Аккуратно перемешайте компоненты реакции пипетированием, сбросьте капли со стенок пробирки на настольной центрифуге.

8. Добавьте по 5 мкл смеси с обратной транскриптазой в каждую пробирку со стадии 5. Аккуратно перемешайте компоненты реакции пипетированием, сбросьте капли со стенок пробирки на настольной центрифуге.

Внимание! Не держите пробирки с реакционной смесью на комнатной температуре дольше, чем это необходимо для добавления второй части реакционной смеси.

9. Инкубируйте пробирки при 42°C в течение 30 мин, сразу по истечении этого времени добавьте к каждой реакционной смеси по 5 мкл раствора «IP-solution» для инициации включения PlugOligo. Аккуратно перемешайте компоненты реакции пипетированием, при необходимости сбросьте капли со стенок пробирки на

настольной центрифуге. Продолжайте инкубацию при 42°С в течение 1 ч и 30 мин.

Внимание! Не держите пробирки с реакционной смесью на комнатной температуре дольше, чем это необходимо для добавления IP-solution.

10. Поместите пробирки в лед для остановки реакции.

Внимание! Полученная первая цепь кДНК может быть использована немедленно для приготовления дц-кДНК или храниться при -20°C в течение 3 месяцев. При хранении пробирок на -20°С на дне может сформироваться бурый осадок. Он не влияет на качество кДНК.