3.2 Разработка и оценка эффективности тест-систем НРИФ и ИФА для определения антигенов P. carinii и антител классов IgG и IgM.

Непрямая иммунофлюоресцентная реакция для выявления антигена P. carinii проводилась по общепринятой методике в нашей модификации. В материалах от больных достоверно выявлялись цисты и трофозоиты.

Непрямая иммунофлюоресцентная реакция для выявления антител проводилась по общепринятой методике (49) в нашей модификации, которая заключалась в использовании оригинального авторского антигена в виде цельных пневмоцист и трофозоитов (50 кл/лунку). Для определения чувствительности и специфичности предлагаемого теста были исследованы 48 сывороток крови от больных пневмоцистной пневмонией, а в качестве контроля – 64 сыворотки доноров крови 42 больных токсоплазмозом.

Анализ полученных результатов показал, что при разведениии испытуемых сывороток 1:20 и более достигалось выявление специфических антител и были исключены ложно-положительные результаты, связанные с неспецифической реакцией.

При интерпретации результатов, полученных в НРИФ, к низкому уровню антител были отнесены разведения 1:20 – 1:40; к среднему –1: 160 и более – к высокому.

ИФА для выявления АТ (IgM и IgG) к P. carinii

В отличие от реакции иммунофлюоресценции, где требовались неразрушенные цисты и трофозоиты, для иммуноферментного анализа были необходимы внутренний и оболочечный антигены пневмоцисты. Поэтому очищенные и сконцентрированные в градиенте плотности перколла пневмоцисты разрушали, подвергая обработке ультразвуком. В надосадочной жидкости содержался внутренний растворимый антиген P. сarinii, тогда как в осадке – поверхностный (оболочечный) нерастворимый антиген. Поверхностный антиген дополнительно обрабатывали 8 М мочевиной, а затем проводили диализ против 0,01 М ФСБ. После диализа пробы с внутренним и поверхностным антигенами объединяли и измеряли концентрацию белка в 1 мл полученного препарата. Для иммуноферментного анализа использовали антиген с концентрацией белка 0,95 – 1,2 мкг/мл.

Поскольку принцип иммуноферментного анализа на твердой фазе известен (50,243), в нашу задачу входило установить оптимальные условия для проведения реакции. Были определены концентрации специфических составляющих тест-систему (антигена и иммуноглобулинов), а также конъюгата, от чего зависела чувствительность и специфичность реакции, подобраны временной и температурный режимы адсорбции антигена и время инкубации сывороток. В реакции был использован антиген с концентрацией белка 5 – 10 мкг/мл. Положительным контролем служили сыворотки реконвалисцентов, собранные в пулы, отобранные в РИФ и содержащие иммуноглобулины класса G в титре 1:160 и более; иммуноглобулины класса М с тиром 1:80. Отрицательные контрольные сыворотки не содержали антител к P. сarinii.

В результате указанных исследований было принято, что при проведении ИФА для выявления антител класса IgG начальное разведение сывороток должно быть 1:100, а для IgM – 1:200. Начальные разведения сывороток являются диагностическими. Специфичность разработанного метода – 100%, чувствительность при выявлении антител классов IgM и IgG – 97,9%.

В ИФА титр антител от 1:100 до 1:200 определяется как низкий, от 1:200 до 1:500 как средний и 1:500 и более – как высокий. Диагностически значимым результатом признается 4 кратная сероконверсия антител класса IgG, а также выявление антител класса IgM, свидетельствующих о наличии острой или недавно перенесенной инфекции.

Сцелью сравнения чувствительности полученных тест-систем для выявления антител к P. carinii классов IgG и IgM были проведены исследования сывороток крови больных манифестной пневмоцистозной пневмонией и доноров г. Москвы. Была показана более высокая чувствительность имуноферментного анализа по сравнению с НРИФ.

С помощью обоих методов были отобраны положительные сыворотки, содержащие антитела в высоких титрах, а также отрицательные сыворотки, на основе которых создана панель для проверки воспроизводимости результатов, которая составила 99%. Стабильность тест-систем проверяли, инкубируя серию при 37⁰С в течение 5 суток. Такая инкубация соответствует хранению тест-систем проверяли, инкубируя серию при 37⁰С в течение 5 суток. Такая инкубация соответствует хранению тест-системы при 4⁰С в течение 6 месяцев. При +4⁰С тест-система хранилась в течение 6 месяцев. Стабильность диагностических препаратов P.carinii сохранялась в течение всего срока испытания.

Объективная оценка результатов титрования в серологической практике

При учете результатов ИФА, исходя из величин экстинкции конечных растворов в лунках с разведениями сывороток 1:2000 и 1:20 000, вычисляя процент связывания антигена, адсорбированного на планшете с антиттелами исследуемых сывороток (методика Мачисона в модификации Накани).

Так например, при использовании разведений сыворотки 1:200 и 1:2000 расчет титра антител может проводится по следующей формуле:

… %;

…%;

S₂₀₀; S₂₀₀₀ – процент связывания антигена, адсорбированного на планшете с антителами, содержащимися в исследуемой сыворотке в соответствующем развведении;

Э_О/С – экстинкция конечных растворов в лунках (отрицательный контроль), обработанных сывороткой, не содержит антител (к ЦМВ или P.carinii);

Э_П/С - экстинкция конечных растворов в лунках, обработанных сывороткой, содержащей анти-ЦМВ или анти-P.carinii (положительный контроль);

Э_{О/С 200} , Э_{П/С 2000} –экстинкция исследуемой сыворотки в соответствующем разведени.

Титром антител к ЦМВ или к P.carinii считают такое разведение сыворотки, в котором она обеспечивает 50% связывания с антигеном. Величину такого разведения высчитывают методом графической интерполяции в полулогарифмической системе координат, где по оси абсцисс (в логарифмическом масштабе) отложены величины разведения исследуемой сыворотки от 1:200 до 1:20 000, а по оси ординат (в линейном масштабе) –процент связывания антигена с антителами. В этой системе наносят точки, сосоответствующие процентам связывания для каждого из разведений (например 1:200 и 1:2000), а затем, соединяя эти точки прямой, находят точку пересечения этой прямой с горизонтальной, проходящей через 50% на оси ординат.

% связывания

99%

90

80

70

60

50

40

30 27%

20

10

1:200 1:970 1:2000

Разведение сыворотки

Пример:

S₂₀₀=90%,

S₂₀₀₀=90%, конечный титр 1:970 (48).

Для целей эпидемиологического анализа необходимо было выяснить сравнительную диагностическую ценность обоих основных методов НРИФ и ИФА. Результаты этой работы представлены в таблице 3.

Таблица 3

Сравнение диагностической эффективности метода НРИФ и ИФА при оценке зараженности пневмоцистами

Из материалов таблицы следует, что диагностическая эффективность методов НРИФ и ИФА при выявлении антител класса IgG составила 95,8 и 97,9% соответственно, а при выявлении антител класса IgM была одинаково высокой (97,9%) у больных пневмоцистной пневмонией.

Выявление антител к P. carinii у 68,8% доноров методом НРИФ и у 71,9% методом ИФА, полностью согласуется с данными литературы о широте распространения пневмоцистной инфекции среди населения в странах Европы (176,201).

Независимая апробация тест-систем НРИФ и ИФА в Омской государственной медицинской академии в 1998 году подтвердила возможность использования указанных тест-систем для клинической диагностики и эпидемиологических исследований. Лысенко В.Я. с соавторами (1996) также дали положительный отзыв на тест-системы НРИФ и ИФА для выявления анти-P. carinii классов IgM и IgG, подчеркивая, что они хорошо дополняют друг друга.