3.3 Разработка и оценка эффективности тест-систем НРИФ и ИФА для определения антигенов ЦМВ и антител классов IgM и IgG

Еще в 1980 году профессор Канторович Р.А. считал, что ЦМВИ заслуживает большого внимания как клиницистов, так и эпидемиологов. Было ясно, что необходимо усовершенствовать старые и разрабатывать новые иммунологические и сероэпидемиологические методы диагностики этой инфекции.

Позже получение активных штаммов ЦМВ с использованием чувствительных клеток фибробластов эмбриона человека, инфицированных штаммом «Весна» и АD-169, позволило разработать тест-системы для определения антител классов IgM и IgG, а также и суммарных антигенов ЦМВ (патент №179889). В последующем было организовано производство опытных, малых серий этих тест-систем, необходимых для эпидемиологических исследований.

Определение суммарных антигенов ЦМВ методом НРИФ

Одним из методов диагностики активной ЦМВИ является определение вирусных антигенов в биологических жидкостях пациентов. Материал центрифугировали при 2000 об/мин 10 минут и из осадка готовили мазки для анализа в НРИФ. Надосадочной жидкостью инфицировали нормальные чувствительные клетки ДККМЧ и наблюдали за ними в течение 3-х недель. В этот период готовили препараты, которые анализировали в НРИФ. При положительной специфической реакции цитомегалические клетки имели как внутриядерные изумрудно светящиеся включения, так и цитоплазменное гранулярное свечение. Чувствительность метода составляла 90%, а специфичность – 88%.

Непрямая иммунофлюоресцентная реакция для выявления антител классов IgM и IgG в сыворотках крови

Для приготовления антигена диплоидные клетки кожно-мышечной ткани эмбриона человека (ДККМЧ) в фазе синтеза ДНК митотического цикла инфицировали ЦМВ. При проявлении цитопатического действия в 90 – 100% поражения клеточного слоя их снимали со стекла, трижды отмывали фосфатным буферным раствором (РН 7,2 – 7,4).

ИФА для выявления антител (IgM и IgG) к ЦМВ

К началу наших разработок отечественных тест-систем для диагностики ЦМВИ на основе ИФА не существовало. Нами был применен и усовершенствован метод непрямого иммуноферментного анализа на твердой фазе (50,162,243) для выявления специфических антител классов IgM и IgG. В этой тест-системе мы использовали антиген с преобладанием белков с молекулярной массой 10 – 60 КDа и содержанием белка 1,36 мг/мл, специфичность которой была проверена в реакциях иммуннофлюоресценции и бласттрансформации. Концентрация антигена ЦМВ в лунке составляла 5 – 10 мкг. Специфичность антигена ЦМВ проверяли в НРИФ с иммунными сыворотками к другим возбудителям ( табл. 2).

В качестве положительных контролей служил сыворотки реконвалесцентов, в которых наличие антител к ЦМВ в высоких титрах было подтверждено ИФА (фирмы АВВОТ). Специфичность положительной сыворотки проверяли в НРИФ с антигенами других возбудителей. Отрицательными контролями служили сыворотки доноров, тестированные в ИФА (Фирмы АВВОТ). Сыворотки хранили при –20⁰С. Постановку НРИФ и ИФА проводили по общепринятым методикам. Чувствительность и специфичность тест-систем НРИФ и ИФА для выявления антител к ЦМВ классов IgG и IgM оценивали их сравнением с тест-системой ИФА фирмы АВВОТ при исследовании сывороток от доноров и беременных женщин с акушерской патологией (табл.4).

Таблица 4

Сравнение диагностической эффективности методов НРИФ и ИФА при оценке инфицированности цитомегаловирусом

Во всех 3-х испытанных тест-системах совпадение результатов в НРИФ и ИФА достигало 96%. ИФА и ИФА АВВОТТ – 92%. Следовательно, обе разработанные нами тест-системы оказались пригодными для использования, однако, иммуноферментная система показала себя как более чувствительная. Эти данные согласуются с результатами, полученными другими исследователями при сравнении методов НРИФ и ИФА для выявления антител к ЦМВ (117,127,168,320).

Апробация тест-системы ИФА для выявления IgG была проведена в двух учреждениях – в РЦПБ СПИД ТАССР г. Казани и в Омском РПЦПБ СПИД. В г. Казани было исследовано 1548 сывороток с целью определения антител к ЦМВ и выявлено 65% положительных образцов. Совпадение результатов в повторных исследованиях свидетельствовало об их достоверности. В исследованиях, проведенных в РЦПБ Омска, было испытано 2700 сывороток, среди которых выявлено 63% положительных.

У отдельных лиц на фоне обнаружения специфических антител были выявлены и антигены ЦМВ в моче методом НРИФ, что свидетельствовалооб активной инфекции. На основании данных проверки был сделан вывод о пригодности данных диагностических тест-систем для их использования при проведении массовых сероэпидемиологических обследований.

Это позволило нам провести скрининговые исследования в целях определения групп риска в отношении указанных инфекций, а также оценить широту распространения этих оппортунистических инфекций.