Природа флуорофоров, ответственных за аутофлуоресценцию глазного дна

Как известно, фотолиз зрительного пигмента родопсина завершается разрывом ковалентной связи между опсином и полностью-транс-ретиналем (ПТР) и высвобождением последнего из хромофорного центра опсина.

При патологии, когда белок-переносчик дефектен, например при болезни Штаргардта (дефектным является белок-переносчик ABCR4), ПТР накапливается в фоторецепторной мембране (Travis, 1998; Островский, 2005; Rozanowska, Sama, 2005).

При избыточном обесцвечивании родопсина в фоторецепторной мембране также может происходить накопление ПТР. Свободный и неудаленный из фоторецепторной мембраны ПТР может легко взаимодействовать с аминогруппой фосфатидилэтаноламина с образованием основания Шиффа - N-ретинилиден- фосфатидилэтаноламина (АРЕ). Именно этот продукт взаимодействия ПТР с фосфатидилэтаноламином удаляется из фоторецепторной мембраны при помощи АТФ-зависимого белка-переносчика (ABCR) (Weng et al., 1999; Saari, 2000; Lamb, Simon, 2004; Molday et al., 2009; Maeda et al., 2012).

Неудаленный АРЕ может вступать во взаимодействие еще с одной молекулой ПТР, приводя к образованию бисретиноидов, в том числе таких побочных и потенциально опасных продуктов, как N-бис-ретинилиден-фосфатидилэтаноламин - А2-РЕ (N-bis-retinylidene-phosphatidylethanolamine), дигидро-А2-РЕ, основания Шиффа между димером ПТР и фосфатидилэтаноламином - ATR-dimer-PE (ATR- dimer-phosphatidylethanolamine conjugate) (Liu et al., 2000; Kim et al., 2007).

В то же время, сам ПТР является эффективным природным фотосенсибилизатором (Harper, Gaillard, 2003; Fu et al., 2003; Liu, Hammand, 2003). По механизму фотосенсибилизированного окисления ПТР способен окислять и белки, и липиды в фоторецепторной мембране. Показано, что он способен повреждать родопсин, межфоторецепторный ретинол-связывающий белок (Островский, Федорович, 1996; Fedorovich et al., 2000), а также мембранный белок-переносчик ABCR (Sun, Nathans, 2001).

До недавнего времени считалось, что при физиологических условиях накопление токсичного и фототоксичного свободного ПТР в наружном сегменте зрительной клетки или не происходит, или является кратковременным. Однако совокупность накопленных к настоящему времени данных свидетельствует о том, что ПТР способен выступать в роли токсического или фототоксического агента, усугубляющего развитие дегенеративных заболеваний сетчатки (Rozanowska, Sama, 2005; Masutomi et al., 2012; Maeda et al., 2012). Другими словами, накопление в фоторецепторных клетках свободного ПТР может рассматриваться как фактор риска усугубляющего действия света при развитии различных дегенеративных заболеваний сетчатки (Островский, 2005; Wang et al., 2003).

В процессе эволюции зрительной системы сформировался достаточно эффективный способ защиты от накопления в клетке молекулярных дефектов и, в том числе, побочных продуктов фотолиза родопсина - бисретиноидов. Постоянное обновление фоторецепторных мембран и всего наружного сегмента зрительной клетки (и палочки, и колбочки) позволяет в норме избегать накопления молекулярных дефектов, благодаря чему молекулярная «машинерия» зрения остается эффективной на протяжении всей жизни. Однако вместе с т.н. фагосомами - «отработанными» и фагоцитированными обломками наружных сегментов фоторецепторных клеток, в клетки РПЭ попадают и (фото)токсичные бисретиноиды.

Долгое время ЛГ считались инертным побочным продуктом жизнедеятельности клетки РПЭ. Однако, во-первых, была показана способность ЛГ генерировать при действии видимого света активные формы кислорода (Островский и др., 1996; Boulton et al., 1993) и, во-вторых, выявлена явная корреляция между накоплением ЛГ в клетках РПЭ и дегенеративными заболеваниями сетчатки, в том числе ВМД (Boulton et al., 1993, 2004; Brunk, Terman, 2002; Островский, 2005). Не вызывает сомнения, что производные ПТР - бисретиноиды, являются фототоксичными для клеток РПЭ (Suter et al., 2000; Ben-Shabat et al., 2002а; Kim et al., 2006) и что их окисленные формы становятся токсичными и в темноте (Ben-Shabat et al., 2002а, Sparrow et al., 2003; Rozanowska, Sarna, 2005).

ЛГ поглощают свет в видимой, в основном коротковолновой (фиолетово-синей), области спектра, и обладают ярко выраженной флуоресценцией. Флуоресцентные свойства ЛГ обусловлены, в основном, наличием в них конъюгатов ПТР различной природы. Однако хорошо изученным является практически только один флуоро- фор, т.н. А2Е (К-ретинил-К-ретинилиденэтаноламин) - продукт взаимодействия двух молекул ПТР с аминогруппой одного из липидов фоторецепторной мембраны - фосфатидилэтаноламина (РЕ) (Parish et al., 1998; Ben-Shabat et al., 2002b). A2E образуется из своего предшественника А2РЕ путем ферментативного гидролиза (рис. 1). Помимо А2Е в ЛГ содержится еще около двадцати флуорофоров, являющихся производными ретиналя (Eldred, Katz, 1988; Sparrow et al., 2009). В настоящее время охарактеризованы такие конъюгаты ПТР, как ПТР-димер (ATR-dimer), ПТР-димер этаноламин конъюгат (ATR-dimer-E), ПТР-димер фосфа- тидилэтаноламин конъюгат (ATR-dimer-PE) (Kim et al., 2007), А2-дигидропиридин- фосфатидилэтаноламин (A2-DHP-PE) и А2-дигидропиридин-этаноламин (A2- DHP-E) (Wu et al., 2009), а также конъюгат ПТР с глицерофосфоэтаноламином (glycerophosphoethanolamine) (A2-GPE) (Yamamoto et al., 2011).

Рис. 1. Последовательность химических реакций, приводящих к образованию молекулы А2Е (і¥-ретинил-і¥-ретинилидеютаноламина) из двух молекул полностью-транс-ретиналя и молекулы PE (фос фатидилэтаноламина)

В присутствии кислорода А2Е может фотоокисляться с образованием различных окисленных форм (Avalle et al., 2004; Dillon et al., 2004). Окисленные продукты А2Е способны оказывать токсическое действие на клеточные структуры уже без участия света (Sparrow et al., 2003; Wang et al., 2006; Wu et al., 2010; Yoon et al., 2012). Эти продукты окисления являются более гидрофильными, чем исходный А2Е. Поэтому они могут высвобождаться из ЛГ (Соколов и др., 2005) и перемещаться в цитоплазме клетки РПЭ в другие клеточные органеллы, например в ядро и в митохондрии РПЭ (Донцов и др., 2009). Окисленные формы А2Е были обнаружены в ЛГ, выделенных как из старческих глаз человека, так и из РПЭ глаз мышей с мутацией в ABCR-гене, моделирующем болезнь Штаргарда и ВМД (Avalle et al., 2004; Radu et al., 2004, Wielgus et al., 2010). При этом были идентифицированы в РПЭ как мышей, так и человека обе формы продуктов окисления А2Е - эпокси- и фуранопроизводные (Jang et al., 2005; Яковлева и др., 2006). Важно подчеркнуть, что образование и накопление окисленных продуктов отражается на спектральных характеристиках ЛГ. Как нами ранее было показано, при действии света (фотоокислении) спектры поглощения и флуоресценции как А2Е, так и самих ЛГ сдвигаются в коротковолновую область (Донцов и др., 2005, 2006, 2009; Яковлева и др., 2006, 2009; Фельдман и др., 2010). Очевидно, что неокисленные и окисленные формы

флуорофоров могут вносить различный вклад в картину аутофлуоресценции глазного дна, что следует учитывать при дальнейшем усовершенствовании этого метода.

Изучение состава и спектральных характеристик флуорофоров, их неокисленных и окисленных форм, содержащихся как в ЛГ клеток РПЭ, так и в фоторецепторных клетках сетчатки, является важным как для понимания природы, так и для интерпретации картины аутофлуоресценции глазного дна, меняющейся в ходе старения и на различных стадиях патологического процесса. Такое изучение важно независимо от того, возбуждается АФ при 488 нм или регистрируется в диапазоне 500-600 нм, как это имеет место в существующем гейдельбергском офтальмоскопе, и это тем более важно, если в будущем удастся получать картину АФ при более коротковолновом возбуждении и более коротковолновой регистрации.

4.