Спектральные характеристики флуорофоров липофусциновых гранул

Считается, что А2Е вносит основной вклад в суммарную картину аутофлуоресценции глазного дна (Ben-Shabat et al., 2002b; Schmitz-Valckenberg et al., 2002). Вопрос о вкладе других флуорофоров в картину аутофлуоресценции глазного дна остается открытым.

Спектральные свойства отдельных флуорофоров (или их групп) и оценка их вклада в суммарный спектр флуоресценции ЛГ были исследованы нами при помощи методов флуорометрии, спектрофотометрии, ВЭЖХ и микроскопии ближнего поля. Для качественной оценки флуорофоров ЛГ были зарегистрированы спектры возбуждения флуоресценции при эмиссии на 335, 450 и 500 нм (Фельдман и др., 2010). Спектр возбуждения с флуоресценцией на 335 нм имеет максимум в области 280 нм. Скорее всего, он принадлежит белковой составляющей ЛГ - флуоресценции триптофана (White, 1959). Спектры возбуждения с флуоресценцией на 450 и 500 нм имеют максимумы в области 270, 350 и 450 нм. Можно предположить, что коротковолновый максимум в области 270 нм принадлежит окисленным формам производных ПТР (Jang et al., 2005), а максимумы в области 350 и 450 нм принадлежат производным ПТР, таким как, например, А2Е и ПТР-димер (Sparrow et al., 2012). При этом существенный вклад в суммарный спектр флуоресценции вносят продукты, поглощающие в ультрафиолетовой области. В силу спектральных характеристик хрусталика и других внутриглазных светофильтров возбуждать эти продукты в ситуации in vivo не представляется возможным.

На рис. 5А представлены спектры поглощения суспензии ЛГ в фосфатном буфере (1) и хлороформного экстракта из ЛГ (2). Видно, что хлороформная фракция содержит вещества с максимумами поглощения в области 280 нм, 340 нм и 430 нм. Методом ВЭЖХ были определены спектральные характеристики отдельных компонентов хлороформного экстракта из ЛГ. На рис. 5Б представлена хроматограмма хлороформного экстракта ЛГ при детектировании на длине волны

Рис. 5. (А) Спектры поглощения суспензии ЛГ в фосфатном буфере (1) и хлороформного экстракта ЛГ (2). (Б) Хроматограмма хлороформного экстракта из ЛГ. Детекция на длине волны 430 нм.

Вертикальными линиями ограничены группы пиков, которые собирались в виде отдельных фракций, для определения спектральных характеристик флуорофоров в экстракте. Эти фракции обозначены буквами /а-з/ (вверху хроматограммы) (Яковлева и др., 2010)

430 нм. Видно, что образец содержит довольно большое количество компонентов. Нами были идентифицированы А2Е (пик № 15), iso-А2Е (пик № 17), а также окисленные формы А2Е (пики №№ 12 и 13). Природа пиков (1-11) с меньшими временами удерживания не известна. Аналогичные пики появляются на хроматограмме при облучении синтетического А2Е белым светом в течение 2 часов (Фельдман и др., 2010). Вероятнее всего - это продукты (фото)окисления и фотодеградации А2Е (Wang et al., 2006; Kim et al., 2010; Yoon et al., 2012). Фракции 18 и 19 могут содержать такие производные ПТР, как A2-DHP-PE и A2-DHP-E (Wu et al., 2009, Sparrow et al., 2010), ATR-dimer, ATR-dimer-E и ATR-dimer-PE (Kim et al., 2007), а также A2- GPE (Yamamoto et al., 2011).

Для определения спектральных характеристик детектируемых веществ нами были отобраны фракции /а-з/ и зарегистрированы их спектры поглощения. Доминирующими продуктами по поглощению в видимой области спектра (400-500 нм) являются А2Е (пик № 15), iso-A2E (пик № 17) и окисленные формы А2Е (фракция /е/, пики 12 и 13). Фракции /а-д/ в большей степени поглощают в ультрафиолетовой области и в меньшей степени - в области 400 нм. Фракция /з/ состоит из группы веществ, поглощающих как в коротковолновой области спектра (в области 300 нм), так и в длинноволновой (в области 500-600 нм).

Полученные нами результаты указывают на то, что в суммарную картину аутофлуоресценции глазного дна могут вносить вклад довольно большое количество флуорофоров, представляющих собой конъюгаты ПТР различной природы.

5.3.