Образование флуорофоров - продуктов взаимодействия свободного транс-ретиналя с аминогруппами белка и липидов в фоторецепторных клетках (исследование in vitro на модельных системах)

Избыточное накопление свободного ПТР в фоторецепторной мембране при некоторых патологиях или в случае интенсивного воздействия света приводит к образованию бисретиноидов - продуктов взаимодействия ПТР с аминогруппами фосфатидиэтаноламина и белковых молекул (А2РЕ и др.).

На рис. 2А представлен спектр поглощения (спектр 3) суспензии наружных сегментов палочек сетчатки (НСП) после темновой инкубации с 10-кратным избытком ПТР в течение 3 суток при 37°C. В этот спектр кроме самого родопсина вносят вклад продукты взаимодействия свободного ПТР с аминогруппами белка и липидов.

Продукты взаимодействия ПТР с аминогруппами родопсина и фосфатидилэта- ноламина обладают характерной и сильной флуоресценцией (Ben-Shabat et al., 2002; Jockusch et al., 2004). Ниже представлены данные флуоресцентного анализа этих продуктов при длинах волн возбуждения 350 и 460 нм (рис. 2Б). При возбуждении 350 нм наблюдаются две выраженные полосы с максимумами в области 480 нм и 545 нм, а при возбуждении 460 нм - одна полоса с максимумами в области 540-550 нм. Анализ спектров флуоресценции (табл. 1) позволяет предположить, что образуются три типа соединений: согласно литературным данным, это могут быть непротонированные Шиффовы основания, протонированные Шиффовы основания и продукты вторичного взаимодействия ПТР с Шиффовым основанием (например А2-РЕ и А2-родопсин).

Рис.

1 - Темновая суспензия НСП (характерный спектр поглощения родопсина в фоторецепторной мембране с максимумом при 500 нм); 2 - темновая суспензия НСП в присутствии 10-кратного избытка ПТР (спектр записан сразу после добавления избытка ПТР, максимум при 380 нм характерен для свободного ПТР); 3 - суспензия НСП, после ее инкубированная в темноте с 10-кратным избытком ПТР в течение 3 суток 37° C. Вставка - спектр поглощения ПТР (максимум при 380 нм). (Б) Спектры флуоресценции суспензии наружных сегментов палочек (НСП) при возбуждении 350 нм (а) и 460 нм (б). 1 - Исходная суспензия НСП; 2 - суспензия НСП в присутствии 10-кратного избытка ПТР; 3 - суспензия НСП, инкубированная в присутствии 10-кратного избытка ПТР в течение 3 суток при 37°С (Логинова и др., 2008)

Таблица 1

Продукты модификации родопсина и липидов, образующиеся при инкубации с экзогенным полностью-шранс-ретиналем в течение 3 суток при 37°С

Рис. 3. Кинетика затухания флуоресценции при возбуждении излучением с длиной волны 353 нм а - родопсин в суспензии НСП; б - ПТР в буфере; в - ПТР, добавленный в 10-кратном избытке к суспензии НСП (регистрация сразу после добавления ПТР, до инкубации); г - родопсин, инкубированный с 10-кратным избытком ПТР в течение 3 суток при 37°С (Логинова и др., 2009)

Для сравнительного исследования фотохимических свойств транс-ретиналя и его конъюгатов с родопсином и липидами были зарегистрированы кинетики затухания флуоресценции в пикосекундном диапазоне времени после их возбуждения импульсом длительностью ~20 пс с длиной волны 353 нм (рис.

Ф^) = X A exp(-t /T_t ) ^,

/

где i - число компонент, А - амплитуды, т - длительность компонент. Найдено, что т₁=48±2 пс (22%), т₂=208±5 пс (48%), т₃=900±10пс (30%). Наличие трех компонент в кинетике флуоресценции инкубированного образца можно объяснить присутствием как минимум 3 центров свечения. Сопоставление с литературными данными (Takeuchi, Tahara, 1997; Tahara, Hamaguchi, 1995; Bachilo et al., 1996; Harper, Gaillard, 2003) позволяет предположить, что первая компонента (48 пс) принадлежит протонированным основаниям Шиффа, вторая компонента (208 пс) принадлежит, по-видимому, А2-производным ретиналя, а третья компонента (900 пс) - непротонированным основаниям Шиффа.

Таким образом, описанная выше модельная система позволяет предположить, что в ситуации избыточного накопления ПТР в фоторецепторной клетке происходит образование как минимум трех типов продуктов (Логинова и др., 2009). Продукты взаимодействия ПТР с аминогруппами фосфатидилэтаноламина и белковых молекул в фоторецепторных мембранах проявляют достаточно сильные флуоресцентные свойства и могут вносить заметный вклад в аутофлуоресценцию глазного дна, например, при патологиях, вызванных нарушением механизма удаления отработанного ПТР при фотолизе родопсина.

5.