1.3.1. Внутренняя мембрана митохондрий

, на которой локализована дыхательная цепь, отличается, как известно, высоким содержанием фосфолипидов с большой в норме степенью ненасыщенности. Это означает, что при наличии дисбаланса D (ПО – АО) митохондрии потенциально высокоуязвимы ввиду повышенной чувствительности их к ПОЛ, о чём свидетельствуют многие публикации о возрастном увеличении в митохондриях интенсивности образования различных АФК и перекисей липидов (Sawada, Karlson, 1987; Sohal, 1994; Tsay et al., 2000; Pfenty, Mignotte, 2001 и др.).

Особенно значительна роль изменений в цитохромной системе – последнем звене, обусловливающем использование О2 в терминальных стадиях биологического окисления. Падение активности цитохромоксидазы и содержания цитохромов а+а3, с+с1 приводит к снижению окислительной способности митохондрий (скорости потребления О2), в результате работа дыхательной цепи не обеспечивает образование достаточного мембранного потенциала для синтеза АТР (Литошенко, 1986; Chen et al., 1998). С инактивацией цитохромоксидазы при избыточном ПОЛ и угасанием функций митохондрий старение клеток ускоряется (показано на гепатоцитах крыс Sprague-Dawley). А каталаза, SOD, GPX, GSH, NO, элиминируя пероксиды, могут защищать цитохромоксидазу и клетку от окислительного стресса, от старения и рака (Ota, 1998). От возраст-ного снижения активности цитохромоксидазы в митохондриях печени мыши защищает также тиоловый антиоксидант N-ацетилцистеин. Последний повышал активность фермента in vitro и в синаптических митохондриях, выделенных от молодых и старых мышей.

В связи с указанным понятно различие окислительного фосфорилирования в митохондриях печени мышей с ускоренным старением (SAMP8) и животных, устойчивых к старению (SAMR1). У 18-месячных мышей SAMP8 не обеспечивается синтез АТР, необходимый для нормального клеточного обмена, и отношение АТР/О2 соответственно уменьшалось. Подавлялось также зависимое от динитрофенола разобщённое дыхание, что указывало на дисфункцию митохондрий. Влияние старения на эти функциональные параметры у мышей SAMR1 было смягчённым. Низкую продолжительность жизни мышей с ускоренным старением связали, естественно, с нарушением у них функции митохондрий (Nakahara et al., 1998). Сходные в принципе результаты получены при иссле-довании активности ферментативных систем генерации АФК у крыс Wistar и преждевременно стареющих крыс OXYS в следующих двух экспериментах.

В одном случае, повышенная чувствительность крыс линии OXYS к окислительному стрессу коррелировала со сниженной способностью выделенных из их печени митохондрий восстанавливать О2 и нарабатывать О и Н2О2. Речь здесь идёт, очевидно, об АФК, образующихся в процессе работы дыхательной цепи. Оказалось, что падение продукции О митохондриями крыс связано с изменениями в комплексе III цепи переноса электронов (Меньшикова и др., 2000). В другом случае, с помощью электронной микроскопии показано, что уже с 12-месячного возраста регистрируются признаки дегенеративно-дистро-фических изменений гепатоцитов крыс линии OXYS. Это происходит на фоне функциональных нарушений митохондрий: снижения скорости поглощения О2 во всех метаболических состояниях, величины дыхательного контроля, коэффициента ADP/O, трансмембранного потенциала и скорости фосфорилирования (Колосова и др., 2001).

Крайне интересен также факт обнаружения в мозге мышей линии с генетически ускоренным процессом старения повышенного уровня митохондриальной моноаминооксидазы Б. Как полагают (Юнева и др., 1998), по этой причине в тканях мозга животных с возрастом усиливается индуцибельность ПОЛ. Действительно, чтобы понять данный эффект, надо иметь в виду, что ами-нооксидазы катализируют реакцию окислительного дезаминирования многих низкомолекулярных азотистых соединений:

R-CH2-NH2 + О2 + H2О → R-CHО + NH3 + H2О2,

где R – жирно-ароматические или алифатические радикалы, причём образующиеся в этой реакции АФК способны индуцировать ПОЛ мембран. В частности, моноаминооксидаза, локализованная во внешней мембране митохондрий, может нарушить, прежде всего, её (Каган и др., 1984а), а также способствовать повреждению, по-видимому, и внутренней мембраны. Таким образом, феномен ускоренного старения в указанном выше случае вполне согласуется с негативными «пероксидативными» сдвигами в митохондриях. Аминооксидазная тема затрагивается нами также в п.2.3.3 в связи с обсуждением и обоснованием кислородно-перекисной модели канцерогенеза.

Указанные эффекты возникают, несмотря на существование в нормальной аэробной клетке специальных механизмов защиты её от избыточного образования АФК (см. Скулачев, 1996). Одним из возможных способов такой защиты митохондрий и клетки в целом считают также утечку протонов через митохондриальные мембраны – процесс, сопровождающийся термогенезом и в норме требующий для своего возмещения затраты значительной части энергоресурсов (Rolfe, Brand, 1997). Протекторную функцию утечки протонов логично объяснить интенсификацией митохондриального дыхания и соответственно производства тепла, снижением уровней рО2 в митохондриях и в клетке, а, сле-довательно, и концентрации в них АФК, скорость образования которых прямо зависит от рО2 (Fridovich, 1975).

Не менее существенно, что снижение митохондриального дыхания, даже при уменьшенной подаче О2 в клетки, является при старении организма преобладающим фактором, который неизбежно повышает уровень внутриклеточного рО2 и содержание АФК, усиливая в качестве положительной обратной связи прооксидантную составляющую дисбаланса D (ПО – АО).

В условиях избыточного рО2 естественны различные негативные процессы. Наглядный пример тому – достоверное увеличение с возрастом отношения окисленного глутатиона к восстановленному (GSSG/GSH) в митохондриях, выделенных из клеток печени, почек и головного мозга крыс и мышей. Ассоциированное с возрастом окисление глутатиона и образование пероксидов в митохондриях предотвращается при пероральном введении животным антиоксидантов (Garcia et al., 1996; Sastre et al., 1998). Изменённый фосфолипидный состав митохондрий гепатоцитов у 18- и 24- месячных крыс, тесно связанный с окислительным повреждением, играет важную роль в возрастном разрушении митохондрий в старости. У животных этих групп значительно увеличено содержание MDA и фосфолипазы А2 по сравнению с получавшими предвари-тельно витамин Е или с более молодыми (Sun et al., 1997). Несколько раньше было показано, что митохондрии скелетной мышцы человека и мышей при старении подвергаются значительным деструктивным изменениям, причём мышечные клетки содержат среди миофибрилл липофусцин нередко в тесной связи с повреждёнными митохондриями.

В процессе старения наблюдается накопление и окисленных митохондриальных белков, содержащих реакционноспособные карбонильные группы. Наличие последних создает возможность образования внутри- и межмолекулярных сшивок, что приводит к потере функциональной активности белков (Ames et al., 1995). Любопытно, что оцениваемая по содержанию карбонилов окислительная модификация белков митохондриальных мембран при старении происходит уже на уровне насекомых. Так, на примере старения летательной мышцы домашней мухи показана значительная окислительная модификация адениннуклеотидтранслоказы митохондрий, сопровождавшаяся потерей её активности. Содержание мух в атмосфере 100 % О2 и в среде, генерирующей ОН˙, также приводит к повышению содержания карбонильных групп и инактивации указанного соединения (Yan, Sohal, 1998).

При старении в митохондриях миокарда и печени крыс вследствие воздействия высокореактивных АФК повреждается ключевой энзим окислительного фосфорилирования F0F1-АТР-синтетаза. Возрастные нарушения структуры и функции этого фермента воспроизводятся in vitro при воздействии свободных радикалов на субмитохондриальные частицы (Guerrieri et al., 1995). А недавно было показано, что 4-гидрокси-2-ноненаль может понижать митохондриальное дыхание путём ингибирования a-кетоглутаратдегидрогеназы – ключевого фермента образования NADH, и с этим фактом связываются потенциальный механизм влияния ПОЛ на дисфункцию митохондрий и роль последней в некоторых дегенеративных процессах (Humphries et al., 1998).

Снижение дыхательной активности митохондрий, их количества и качества в целом объясняется и более серьёзными нарушениями их структуры и свойств при старении. Объектом постоянной атаки АФК и продуктов липопероксидации, генерируемых на внутренней мембране митохондрий, оказывается локализованная рядом с ней, в матриксе, митохондриальная ДНК (мтДНК).

В последующие годы данные об окислительном повреждении мтДНК, выделенной из тканей старых людей и животных, подтверждались и приводились в литературе неоднократно. Большинство исследователей связывает эту составляющую процесса старения митохондрий и клетки в целом с пониженной надёжностью электронотранспортных мембран и образованием токсичных радикалов О2 (Кольтовер, 1987; Литошенко, 1992; Beckman et al., 1992; Mecocci et al., 1994; Sohal, 1994). Об этом свидетельствует и более поздняя сводка материалов о способности кислородных радикалов инициировать реакции окисления нуклеотидов мтДНК (Кольтовер, 1996; Garcia et al., 1996; Литошенко, Хартвиг, 1998). Такие повреждения не могут не отразиться на количественном и качественном составе мтДНК, на синтезе ферментов окислительного фосфорилирования, контролируемом митохондриальным геномом.

Отметим, например, работу, в которой для исследования роли мтДНК в процессе старения использовали лиц в возрасте от 20 недель до 103 лет. Оказалось, что имеет место существенное возрастзависимое снижение содержания мтДНК в клетках при отсутствии, правда, какой-либо корреляции со снижением скорости потребления О2 (Landerman et al., 1995). Кстати, измерение числа копий мтДНК, количества субъединицы I цитохромоксидазы, уровня её транскрипции и ферментативной активности в различных мышцах, печени и сердце у 6- и 27-месячных крыс показало следующее. Значительное уменьшение с возрастом числа копий мтДНК имело место в скелетных мышцах и печени, но не в сердце. Экспрессия же гена цитохромоксидазы носила тканеспецифический характер (Barazzani et al., 2000).

Все сдвиги, подобные указанным выше, и митохондриальную теорию ста-рения в целом Зотин и Зотина (1993) обосновывают с позиций термодинамически неравновесных процессов. Лемешко же (1992), рассматривая биоэнергетические аспекты механизма старения, наиболее важным считает модификацию ядерного генома фрагментами мтДНК, образование и выход которых из матрикса зависят от кальция и свободных радикалов. Такая модификация должна обнаруживаться не только при старении, но и, очевидно, при обусловленных им возрастных болезнях (см. п.1.7), к числу которых относится и рак. Как на факт присутствия в яДНК опухолевых тканей вставок, подобных мтДНК, можно сослаться, например, на данные Хадлера и соавт. (Hadler et al., 1998). Содержание этих вставок в опухолях мыши и крысы было существенно выше, чем в гомологичных нормальных тканях. Кроме того, мтДНК-содержащие последовательности в ядерном геноме обладали повышенной мобильностью.