Иммунологические исследования

Определяли клеточные показатели (лейкограмму, фагоцитарную актив­ность нейтрофилов (табл. 1), субпопуляции лимфоцитов - CD3,CD4, CD8, CD20 (табл. 2),) и гуморальные показатели (содержание иммуноглобулинов А, G и М (табл.

Материалом для исследования служила кровь из пальца обследуемых па­циентов. Количество клеток и их соотношение подсчитывали в камере Горяева, для определения клеточного состава готовили мазки, которые окрашивали по Романовскому - Гимза.

Для постановки клеточных реакций, а именно фенотипирования лимфоци­тов и функциональной активности нейтрофилов и эпителиоцитов забирали по 0,05 мл крови и помещали ее в лунки планшета с 1,8 мл. дистиллированной во­ды. Перемешивали в течении 45 секунд, таким образом проводили лизис эрит­роцитов, после чего добавляли 0,2 мл. 10-кратного физиологического раствора с 3% желатина. Полученную суспензию клеток хранили не более 2-х часов. Для определения содержания IgA, IgM и IgG забирали из пальца по 0,4 — 0,5 мл кро­ви в сухие пробирки Эпиндорф.

Таблица 1

Изучавшиеся клеточные показатели периферической крови

Фенотипирование лимфоцитов

Для исследования фенотипа клеток по CD — маркерам, планшет с клетками (для постановки клеточных реакций) осаждали центрифугированием при 50 g в течение 5 мин. Надосадочную жидкость удаляли, к осадку добавляли 2 мл фи­зиологического раствора и вновь центрифугировали в том же режиме, после че­го надосадок удаляли, а к осадку добавляли 0,25 мл физиологического раство­ра. Полученную суспензию клеток использовали для постановки реакции*, фе­нотипирования лимфоцитов, определения функциональной активности нейтро­филов и эпителиоцитов.

Постановку реакций фенотипирования лимфоцитов осуществляли при по­мощи стрептовидин-биотинового метода с моноклональными антителами к CD₃₊, CD₄₊CD₈₄- и CD₂₀+b микромодификации [55].

Получение монослоя лейкоцитов. Монослой лейкоцитов готовили на планшетном цитороторе. В лунки планшета вносили по 0,1 мл суспензии лей­коцитов и центрифугировали при 200g в течение 10 мин.

Таблица 2

Изучавшиеся субпопуляции лимфоцитов у обследуемых пациентов

Таблица З

Изучавшиеся гуморальные показатели периферической крови у об­

следуемых пациентов

Далее в лунки вносили по 0,05мл фиксатора, инкубировали в течение 10 мин, надосадочную жидкость удаляли встряхиванием. Осадок клеток, находя­щийся в виде монослоя на триацетатной пленке (ТАЦ), отмывали, осторожно добавляя в лунки 0,2 мл промывочного буфера, затем стряхивали его. Отмывку повторяли еще 4 раза.

Здесь и в конце каждого последующего этапа проводили пятикратную от­мывку осадка клеток, каждый раз осторожно заполняя лунки промывочным раствором и затем стряхивая его. Следили за тем, чтобы в процессе реакции монослой лейкоцитов не высыхал.

Блокирование эндогенной пероксидазы. В лунки планшета вносили по 0,025 мл блокирующего реагента. Инкубировали во влажной камере 10 мин. За­тем раствор стряхивали, а осадок лимфоцитов отмывали фосфатным буфером.

Реакция с первичными антителами. В лунки, содержащие монослой лей­коцитов, вносили по 0,025 мл растворов первичных моноклональных антител к CD3, CD4, CD8, или CD20 рецепторам, инкубировали во влажной камере 20 мин. Осадок отмывали.

Реакция с вторичными биотинизированными антителами. К осадку до­бавляли по 0,025мл растворов вторичных антител с биотином, инкубировали во влажной камере 10 мин. Осадок отмывали.

Присоединение стрептавидин -пероксидазного комплекса. В лунки план­шета вносили по 0,025 мл стрептавидин - пероксидазного реагента, инкубиро­вали во влажной камере 10 мин. Осадок отмывали.

Выявление пероксидазы. К осадку лимфоцитов добавляли по 0,025 мл хро­могенного субстрата (DAB) и инкубировали во влажной камере 3-5 мин (время окрашивания подбирали экспериментально). Реактив стряхивали в специаль­ный отдельный контейнер (т.к. он является канцерогеном). Осадок клеток три­жды отмывали, вносили в лунки по 0,1 мл дистиллированной воды и затем стряхивали ее.

Докрашивание. Препараты докрашивали, внося в лунки по 0,05мл краски на основе метилового зеленого с добавлением пиронина, инкубировали 5-10 мин (время окрашивания подбирали экспериментально).

Полученные препараты заключали в пихтовый бальзам и приклеивали к предметному стеклу.

Подсчет окрашенных лимфоцитов проводили на 200 клеток в стволовом микроскопе при увеличении окуляра хЮ и объектива на х40. При этом все клетки были окрашены в голубой цвет, а меченные клетки имели коричневый ободок той или иной интенсивности. В отрицательных контрольных образцах темно-коричневого окрашивания не наблюдалось.

Определение функциональной активности фагоцитов

Оценку функциональной активности фагоцитов проводили с клетками пе­карских дрожжей Sacharomy, фиксированных нагреванием [52]. Постановку ре­акции фагоцитоза проводили в 96-луночных планшетах. В лунку планшета вносили по 0,05 мл суспензии клеток крови, приготовленной, как указано выше

и 0,05мл 0,05%-ной суспензии фиксированных клеток пекарских дрожжей. По­сле чего клетки осаждали центрифугированием при 200g в течение 5 мин и планшет инкубировали при 8-10°С в течение 30 мин. Добавляли 0,025 мл фик­сатора на основе глутарового альдегида и инкубировали 10 мин. При той же температуре надосадочную жидкость удаляли встряхиванием планшета, к осад­ку добавляли 0,1 мл краски метиловый зеленый - пиронин, далее планшет на­крывали триацетатной пленкой, покрытой слоем желатина. Пленку плотно прижимали при помощи жесткой крышки с зажимами. Осадок ресуспендирова- ли интенсивными постукиваниями планшета. Клетки осаждали центрифугиро­ванием планшета дном лунок вверх при 200g в течение 10 мин, затем пленку осторожно вынимали из планшета и высушивали в токе теплого воздуха. Опо­ласкивали в проточной воде и вновь высушивали. Полученные препараты за­ключали в пихтовый бальзам, тем самым приклеивая к предметному стеклу.

Учет результатов осуществляли при помощи светового микроскопа при увеличении объектива х20 и окуляров на х10. Подсчитывали количество (%) фагоцитирующих нейтрофилов на 100 нейтрофилов. За фагоцитирующий счи­тали нейтрофил, захвативший хотя бы 1 дрожжевую клетку.

Количественное определение содержания иммуноглобулинов IgA, IgG и IgM в сыворотке крови

Содержание иммуноглобулинов IgA, IgG и IgM в сыворотке крови опреде­ляли методом иммуноферментного анализа (ИФА) (рис. 1).

Принцип метода состоит в следующем. Используется твердофазный сэндвич метод ИФА. На первой стадии калибровочные пробы и исследуемые образцы крови из пальца инкубировали в лунках стрипированного планшета с иммоби­лизованными моноклональными антителами к иммуноглобулинам соответст­вующего класса - IgA, IgG и IgM (Вектор-Вест, Россия). После чего планшет отмывали.

41

Рис. І. Вертикальный фотометр для ИФА.

На второй стадии связавшийся в лунках IgA, IgG или IgM обрабатывали конъюгатом моноклональных антител к иммуноглобулинам соответствующего класса. Затем избыток коньюгата отмывали, а образовавшиеся иммунные ком­плексы « иммобилизированные моноклональные антитела - иммуноглобулины соответствующего класса - коньюгат» выявляли ферментативной реакцией пе­роксидазы с перекисью водорода в присутствии хромогена - тетраметилбензи- дина (ТМБ).

Результаты анализа регистрировали фотометрически при длине волны 450 нм. Измеряли оптическую плотность, строили калибровочный график: по оси абсцисс - концентрация соответствующего иммуноглобулина, по оси ординат - оптическая плотность соответствующих калибровочных проб. По калибровоч­ному графику определяли концентрацию иммуноглобулина соответствующего класса в сыворотке крови.

Исследование показателей местного иммунитета в слюне и смыве изо рта

Материалом для исследования служила слюна и смыв изо рта (табл. 4). Метод получения смыва изо рта: За 60 мин до взятия смыва рот тщательно опо­ласкивали дистилированной водой для удаления механических примесей. По­сле чего в рот набирали 8мл физиологического раствора, полоскали рот (пре­имущественно передний отдел) 1 мин, жидкость возвращали в одноразовую пробирку (на 15 мл).

Клетки промывной жидкости удаляли центрифугированием при 200g в те­чение 10 мин. Надосадочную жидкость удаляли, к осадку добавляли 10мл фи­зиологического раствора. Подсчитывали количество клеток в камере Горяева по формуле:

Количество клеток в смыве, млн: 2,5 х10’³а,

где, а - количество клеток (эпителиальных или нейтрофилов) в 100 боль­ших квадратах камеры Горяева.

Если количество клеток превышало 0,1 млн, то суспензию клеток разводи­ли физиологическим раствором до концентрации 0,05-0,1 млн в 1мл. Получен­ную суспензию использовали для постановки клеточных реакций.

Постановка иммунологических реакций с клетками смыва

Реакции розеткообразования и фагоцитоза проводили в 96 луночных круг­лодонных планшетах для иммунологических реакций одноразового примене­ния. В лунки планшета вносили 0,05мл суспензии клеток смыва изо рта. Далее в 1-ю лунку добавляли 0,05 мл 0,05% - ной суспензии эритроцитов барана, во 2- ю лунку - 0,05мл 0,05%-ной суспензии клеток пекарских дрожжей, фиксиро­ванных нагреванием и центрифугировали при 200g в течение 5 мин.

Изучавшиеся иммунологические показатели смыва из ротовой полости

Рис. 2. Центрифуга ОПН-8 для определения местного иммунитета.

После чего планшет инкубировали при 8-10 °С ЗОмин. Затем в каждую лунку добавляли 0,025 мл фиксатора (0,8% раствор глутарового альдегида), ин­кубировали при 20°С Юмин. Надосадочную жидкость вытряхивали из лунок, а к осадку добавляли 0,1мл краски метиловый зеленый пиронин. Выдерживали при 20°С Юмин. Затем планшет накрывали ТАЦ - пленкой, покрытой слоем желатина, которую плотно прижимали крышкой с зажимами. Клетки ресуспен- дировали интенсивными постукиваниями планшета и центрифугировали при 200g в течение 10 мин дном вверх (рис. 2). В результате клетки осаждались на пленку. Пленку осторожно вынимали и высушивали в токе теплого воздуха, за­тем промывали проточной водой и вновь высушивали. Учет результатов вели с использованием светового микроскопа при увеличении объектива х20, а окуля­ров на хЮ. В препаратах с эритроцитами барана (Е-РОЕ) просчитывали отно-

45

сительное количество (%) розеткообразующих нейтрофилов (Е-РОН) и относи­тельное количество (%) эпителиальных клеток. За розеткообразующую считали нейтрофил, присоединивший 10 и более эритроцитов барана. За розеткообра­зующую эпителиальную клетку считали такую, которая присоединила 10 и бо­лее эритроцитов барана. В препаратах с клетками пекарских дрожжей (Д-РО) просчитывали относительное количество (%) розеткообразующих эпителиаль­ных клеток, относительное количество (%) розеткообразующих нейтрофилов (Е-РОН) и количество (%) фагоцитирующих нейтрофилов. Розеткообразующие клетки выявляли так, как описано выше. За фагоцитирующий нейтрофил при­нимали клетку, захватившую хотя бы одну дрожжевую частицу.

Определение содержания секреторного IgA в слюне

Уровень содержания slgA в смыве изо рта определяли методом иммуно- ферментного анализа (ИФА) по той же методике, что и для иммуноглобулинов А, М, G.

После постановки пероксидазной реакции стоп-реагентом результаты учи­тывались фотометрически с использованием планшетного фотометра при длине волны 450нм. Измерение оптической плотности проводили в один прием во всех использованных лунках планшета не более, чем через 3 мин после оста­новки реакции. Концентрацию slgA в нг/мл в исследуемых образцах определя­ли, нанося соответствующие значения оптической плотности на калибровочный график прилагаемый к набору, а затем перемножали полученные величины концентраций на коэффициент разведения образца.

2.1.2.