Бактериологические исследования

Для проведения бактериологических исследований нами были сформиро­ваны три группы пациентов:

Первая (А)- контрольная группа, которая состояла из 16 здоровых лиц (МГМСУ, 8 женщин и 8 мужчин в возрасте от 30 до 40 лет) с нормальным со­стоянием микробиоценоза рта.

46

Вторая группа (Б) — включала 16 человек, нуждающихся в съемных проте­зах с жесткими и с двухслойными базисами, принимавших препарат Ликопид.

Третья группа (В) — состояла из 16 пациентов, нуждающихся в съемных протезах с жесткими и с двухслойными базисами, принимавших препарат Иму­дон.

Пациенты второй и третьей групп, делились на три подгруппы в зависи­мости от наличия той или иной общесоматической патологии:

Б1, В1 - с заболеваниями желудочно-кишечного тракта (ЖКТ);

Б2, В2 - с заболеваниями сердечно-сосудистой системы ;

БЗ,ВЗ - с хроническим тонзиллитом.

У пациентов групп Б и В исследовали количественный и качественный со­став микрофлоры рта в различные сроки: до ортопедического лечения и через 10 дней; 1,5; 3; 6; 12 месяцев после его окончания.

Пациентов, принимавших в момент обследования антибактериальные пре­параты, не было. Всем пациентам до ортопедического лечения проводилась плановая санация рта.

Бактериологические исследования проводили в соответствии с общепри­нятыми правилами клинической микробиологии на кафедре микробиологии МГМСУ.

Мазок для микробиологического исследования аэробной флоры брали ут­ром натощак стерильным тампоном со слизистой оболочки щек и неба. Посев производился на стандартные микробиологические среды: мясо-пептоный агар и 5% кровяной агар (для получения колоний аэробной флоры рта). С целью по­лучения изолированных колоний микроорганизмов пользовались методом ’’ис­тощения”. После инкубации посевов при температуре 37°С производили учет выросших колоний (рис. 3).

Материал для исследований на наличие анаэробов забирался со строгим соблюдением правил асептики.

47

вой жидкости исследовали, используя метод количественного забора микропи­петками, капиллярами.

Для транспортировки образцов, предназначенных для исследования на на­личие анаэробных бактерий использовали специальные пробирки с транспорт­ной средой. Доставку материала осуществляли в пределах 5-6 часов при темпе­ратуре 4-6 градусов. Доставленный материал гомогенизировали ультразвуком при частоте 15 кГц в течение 10 минут и проводили количественный секто­ральный посев на среды, предназначенные для культивирования бактерий рта в анаэробных условиях.

Рис. 3. Колонии пародонтопатогенов на кровяном агаре. Собствен­ное исследование на кафедре микробиологии МГМСУ.

Для создания строго анаэробных условий использовали комплекс техниче­ских приёмов, направленных на защиту микроорганизмов от токсического дей­ствия кислорода.

В работе применяли: а) анаэростаг (рис. 4)

48

Рис. 4. Культивирование анаэробных пародонто- патогенов с использованием анаэростатов.

б) вакуумный насос, создающий разрежение-1 атм.

в) газ, свободный от примеси кислорода.

Колонии, выросшие только в анаэробных условиях, расценивали как обли­гатные анаэробы и идентифицировали по общепринятым схемам

2.1.3. Изучение агрегации тромбоцитов

Экспериментальная часть работы по изучению влияния Ликопида (фирма Пептек, Россия) на гемостаз заключалась в оценке изменения функции тромбо­цитов кроликов «in vitro» и «in vivo».

В настоящей работе опыты по влиянию Ликопида на агрегационную спо­собность тромбоцитов были проведены на 58 кроликах породы «Шиншилла»

обоего пола, массой 2,5-3,5 кг. При проведении измерения агрегационной спо­собности кровяных пластинок «in vitro» препарат вносился непосредственно в кювету агрегометра в соответствующих концентрациях. В условиях «in vivo» оценка тромбоцитарного звена гемостаза проводилась через 30 мин, 90 мин и 270 мин после парентерального введения Ликопида в дозе 100 мкг/кг и 300 мкг/кг.

Изучение влияния исследуемого препарата на агрегационную способность тромбоцитов

Агрегационную способность тромбоцитов определяли по методу Вот [148]. Принцип метода заключается в измерении степени изменения оптической плотности плазмы, богатой тромбоцитами, при добавлении к ней индуктора аг­регации.

Для получения плазмы богатой тромбоцитами кровь, взятую из краевой вены уха кролика, стабилизировали 3,8% раствором цитрата натрия и центри­фугировали при 1000 об/мин в течение 10 мин.

Верхний надосадочный слой, обогащенный тромбоцитами, отбирали пи­петкой с пластиковым наконечником и хранили во время эксперимента при температуре 37°С в закрытой силиконовой пробирке. Плазма, богатая тромбо­цитами, должна содержать в среднем 3 х 10⁸ кровяных пластинок в 1 мм³. Если плазма содержала большее количество тромбоцитов, ее разводили до выше ука­занной концентрации (3 х 10⁸) плазмой, бедной тромбоцитами, которую полу­чали центрифугированием крови по 3000 об/мин в течение 10 минут. Контроль за количеством тромбоцитов осуществляли в камере Горяева с помощью мик­роскопа МБП - 1с.

Исследование агрегации тромбоцитов проводили на агрегометре фирмы «Chronolog» производства США (рис. 5). В ходе эксперимента в кювету агре-

50

гометра помещали с помощью автоматической пипетки 490 мкл плазмы бога­той тромбоцитами и добавляли с помощью микрошприца 5 мкл раствора, со­держащего исследуемое лекарство. После этого кювету помещали в агрегометр, опускали в нее магнитную мешалку, покрытую тефлоном, и инкубировали смесь в агрегометре в течение 5 минут при постоянном перемешивании. Запись агрегатограммы проводили после добавления 5 мкл раствора, содержащего ин­дуктор агрегации.

Рис.

В качестве индуктора агрегации использовали аденозиндифосфорную ки­слоту (АДФ) производства фирмы «Sigma» (США), в конечной концентрации 1 х10'⁵М.

При графической регистрации процесса агрегации тромбоцитов получали кривые (агрегатограммы), отражающие изменения оптической плотности плаз­мы. При настройке агрегометра за 100% принимали оптическую плотность бо-

гатой тромбоцитами плазмы, за 0% - оптическую плотность бедной тромбоци­тами плазмы.

Антиагрегационное действие исследуемого препарата оценивали количе­ственно с помощью формулы:

Р= ((А-В)х100%)/А

Где: А - максимальное падение (плато агрегатограммы) оптической

плотности плазмы в контроле;

В - то же при добавлении исследуемых веществ.

Следует отметить, что степень и скорость агрегации тромбоцитов зависят от концентрации индуктора и для стандартизации и сравнимости результатов исследований принято их проводить с использованием пороговой концентра­ции индуктора, ниже которой агрегация обратима, а выше не обратима. Значе­ние пороговой концентрации АДФ определяли в каждой серии экспериментов отдельно, их величины варьировали в интервале (0,5-2,0) • 10’⁵М

Оценка скорости агрегации в работе не использовалась по двум причинам: 1) из-за взаимной положительной корреляции амплитуды и скорости агрегации, то есть из-за их пропорциональности друг другу, 2) из-за неточности оценки методом касательных.

Репрезентативность полученных данных обеспечивалась использованием образцов плазмы от 6 животных для каждого образца в 2-3 параллелях.

2.2.