Методы иммунологического исследования

2.5.1. Показатели общего иммунитета

Анализ показателей общего иммунитета проводили при первичном обращении пациентов, анализ показателей местного иммунитета выполняли до начала лечения и через три месяца терапии у пациентов 1 и 2 групп.

Для оценки состояния системного (общего) иммунитета у больных определяли следующие показатели крови:

• Общее количество Т-лимфоцитов (CD3+), %, г/л

• «активные» лимфоциты (CD4+/25+), %

• Т-хелперы (CD4+), %

• ЦТЛ ^D3+/CD8+), %

• Баланс иммунорегуляторных клеток (CD8+/CD4+), %

• Число В-лимфоцитов (CD22+), %

• Иммуноглобулины крови, г/л:

o IgA

o IgM

o IgG

• Фагоцитарная активность нейтрофилов периферической крови:

о Фагоцитарный индекс (ФИ)

о Фагоцитарное число (ФЧ)

о КЗФ

Определение общего количества Т-лимфоцитов, их субпопуляционного состава, а также числа В-лимфоцитов проводилось при помощи

моноклональных антител (МКАТ) методом проточной лазерной цитометрии. Это один из современных методов исследования иммунитета, при проведении которого МКАТ реагируют строго специфично с одним типом рецепторов на поверхности клетки, что позволяет получить точные результаты. Для определения количества зрелых Т-лимфоцитов использовались МКАТ специфичности CD3+. Субпопуляционный анализ иммунорегуляторных Т-лимфоцитов определяли с помощью МКАТ специфичности CD4+ (хелперно-индукторные) и CD8+ (супрессорно-цитотоксические). Оценка количества В-лимфоцитов проводилась с помощью МКАТ специфичности CD 19+ и CD22+.

Функциональная активность В-лимфоцитов определялась по уровню секретируемых ими иммуноглобулинов методом иммунодиффузии в агар с использованием моноспецифических антисывороток к сывороточным IgA, IgM, IgG по Mancini G.(1965 г.), в модификации Чернохвостовой Е. В. (1987 г.) [71, 139].

Сущность метода заключается в том, что в агар, где предварительно диспергирована моноспецифическая антисыворотка, вносят эталонную сыворотку человека с известным содержанием иммуноглобулинов и испытуемые сыворотки крови человека.

Фагоцитарная функция нейтрофилов изучалась с бактериальной тест- культурой. Подсчитывался процент фагоцитирующих нейтрофилов - фагоцитарный индекс (ФИ) и количество фагоцитированных микробов в одном нейтрофиле из 100 сосчитанных клеток - фагоцитарное число (ФЧ).

2.5.2 Показатели местного иммунитета

Иммунная система полости рта включает в себя две подсистемы, одна из которых представлена клеточными компонентами различных отделов полости рта и синтезируемых ими иммуноглобулинов, другая - клеточными и гуморальными факторами общего иммунитета, поступающими в полость рта через десневую борозду из общего кровотока.

Для оценки состояния местного иммунитета в полости рта проводили анализ слюны пациентов (секреторные факторы) и анализ смывов из полости рта (клеточные факторы). Для исследования использовали нестимулированную смешанную слюну в количестве 3-5 мл, которую собирали в пластиковую пробирку через 1 час после еды. Для получения смыва из полости рта пациенту предлагали ополоснуть полость рта 10 мл 0,9% раствора хлорида натрия в течение 2-3 минут, смыв собирали в пластиковую пробирку. Пробирку с клетками смыва центрифугировали, осадок отмывали раствором Хенкса, затем раствор Хенкса добавляли до концентрации клеток 2х10⁶ кл/мл. Жизнеспособность клеток определяли по окрашиванию 0,3% раствором трипанового синего (окрашиваются только мертвые клетки). В реакцию допускался смыв с содержанием не менее 60% жизнеспособных нейтрофилов.

Определяли следующие показатели:

• Общее число нейтрофилов в смыве из полости рта,%

Для определения количества нейтрофилов в смывах проводили цитологию смывов с подсчетом клеток.

• Субпопуляционный состав нейтрофилов:

о Поздние нейтрофилы (EN-PO), %. Это зрелые нейтрофилы, обладающие наиболее высокой фагоцитарной активностью и набором

бактерицидных белков и ферментов, участвующих в разрушении поврежденных при воспалении клеток и тканей организма.

o Двойные нейтрофилы (ДРОН), %. Это предшественники поздних нейтрофилов, количество которых должно увеличиваться при уменьшении содержания поздних нейтрофилов и, соответственно, снижении клеточных механизмов защиты.

Оценка субпопуляционного состава нейтрофилов проводилась с помощью эритроцитарных маркеров в реакциях розеткообразования (И.В.Петрова и соавт., 1984 г.) с выявлением числа EN-PO в реакции спонтанного розеткообразования и числа ДРОН в реакции комплементарного розеткообразования.

Непосредственно перед постановкой реакции готовили суспензию эритроцитарных маркеров. Для этого проводили отмывание физиологическим раствором эритроцитов барана (ЭБ) центрифугированием до тех пор, пока надосадочная жидкость не становилась бесцветной. Из отмытого осадка готовили 0,5% суспензию эритроцитов на среде 199.

Определение числа поздних нейтрофилов (EN-PO) посредством реакции спонтанного розеткообразования. Нейтрофилы имеют на своей поверхности рецепторы к эритроцитам барана (ЭБ-рецепторы), при фиксации ими эритроцитов барана происходит образование «розетки». К 0,1 мл осадка клеток добавляли 0,1 мл 0,5% раствора эритроцитов барана, инкубировали смесь при t - 37 C 5 минут, далее в холодильнике 2 часа для образования розеток. Затем добавляли для фиксации розеток 0,05 мл 0,6% раствора глютаральдегида и оставляли на 20 минут при комнатной температуре. Отмывали от дальнейшего воздействия глютаральдегида физиологическим раствором 2 раза путем центрифугирования, затем делали мазки, сушили, фиксировали в спирте, красили по Романовскому- Гимза и подсчитывали число розеткообразующих нейтрофилов (Е - эритроцит, N - нейтрофил, РО - розеткообразование). Розеткой считается клетка, присоединившая не менее 3х эритроцитов.

Определение количества двойных нейтрофилов (ДРОН) проводили в реакции комплементарного розеткообразования. Ранние нейтрофилы, помимо ЭБ-

рецепторов на своей поверхности имеют рецепторы к комплементу (С) и, поэтому, обозначаются как двойные нейтрофилы (ДРОН).

• Фагоцитарная функция нейтрофилов:

о Фагоцитарный индекс (ФИ) - это процент фагоцитирующих нейтрофилов, являющийся показателем активности фагоцитоза.

о Фагоцитарное число (ФЧ) - это число микробов, фагоцитированных в среднем одним нейтрофилом. Данный показатель отражает интенсивность фагоцитоза.

Для определения фагоцитарной функции нейтрофилов проводился тест с бактериальной культурой по методу И.Я. Серебрийского и соавт. (1950): к 0,1 мл осадка клеток смыва добавляли 0,1 мл взвеси бактериальной тест - культуры, содержащей 2 млрд. микробных тел в 1 мл физиологического раствора. Смесь инкубировали при t - 37 C в течение 30 минут, делали мазки, высушивали, фиксировали в спирте и окрашивали по Романовскому- Гимза в разведениях 1:20. В мазках подсчитывали процент фагоцитирующих нейтрофилов - ФИ, а также подсчитывали число микробов, фагоцитированных в среднем одним нейтрофилом - ФЧ.

• Соотношения для оценки секреторных механизмов защиты:

о S-IgA/IgG - соотношение уровня секреторного S-IgA, образующегося в полости рта в результате взаимодействия В- лимфоцитов (синтезирующих субъединицы IgA) и эпителиальных клеток, продуцирующих секреторный компонент (S), к IgG. Данный показатель указывает на преобладание защитного секреторного S-IgA, либо преобладание воспалительного компонента (IgG).

о S-IgA/IgA - соотношение, являющееся показателем

способности эпителиальных клеток слизистой оболочки полости рта синтезировать секреторный S-компонент,

необходимый для синтеза S-IgA.

• Соотношения для оценки взаимосвязи между секреторными, гуморальными и клеточными компонентами защиты в полости рта:

о IgG/ФИ

о IgG/ФЧ

Концентрацию иммуноглобулинов в слюне определяли методом радиальной иммунодиффузии (РИД) в геле по Манчини (Mancini G. et al., 1965) с использованием моноспецифических антисывороток к S-IgA, IgA, IgM, IgG. Так как концентрация иммуноглобулинов в секретируемых жидкостях значительно ниже, чем в сыворотке крови, то при их определении в агар диспергировали антисыворотки в концентрациях в 3-4 раза меньших, чем при определении сывороточных иммуноглобулинов.

Также проводили расчет индексов аллергизации и интоксикации. Нормальное значение лейкоцитарного индекса интоксикации (ЛИИ) находится в пределе от 0,5 до 1,0. Формула для расчета ЛИИ:

В основу индекса аллергизации (ИА) было положено соотношение суммы

лимфоцитов и эозинофилов к остальным клеткам белой крови. В норме индекс аллергизации составляет 0,7-1,0.

2.6.