1.4 Особенности лабораторной диагностики респираторно-синцитиальной вирусной инфекции

Этиологическая расшифровка ОРВИ принципиально важна у детей первых лет жизни, так как она влияет на назначение правильной терапии, снижает необоснованное назначение антибиотиков, уменьшает продолжительность госпитализации, способствует значительному сокращению необоснованного применения дорогостоящих лабораторных исследований [1, 31, 73].

Частота подтверждения этиологии ОРВИ зависит от многих факторов: времени и правильности взятия клинического материала, правильного выбора метода лабораторной диагностики, возраста пациентов, тяжести течения заболевания, наличия лечения [153, 170]. По данным литературы у детей первых лет жизни уровень этиологической расшифровки всегда выше, что обусловлено большей вирусной нагрузкой в секретах респираторного тракта [97], замедленной элиминацией вируса в связи с несостоятельностью иммунной системы, наличием благоприятных условий для распространения респираторных инфекций в яслях и детских садах из-за большой скученности в помещении [164]. Кроме того, несостоятельность иммунной системы у пациентов первых 2 лет определяет низкую диагностическую ценность серологического метода. Эти обстоятельства диктуют врачам необходимость использования у пациентов разного возраста различных способов этиологического подтверждения диагноза.

Лабораторная диагностика РСВИ включает в себя использование методов прямого выявления вируса, его антигенов или РНК [137]: исследование мазков из ротоглотки с помощью культурального, иммунофлюоресцентного и иммунохроматографического методов, ПЦР, иммуноцитохимического исследования (ИЦХ), а также исследование лимфоцитарной взвеси для выявления антигенов вируса в ИЦХ или генетического материала РСВ в ПЦР. Основным методом серологической диагностики является иммуноферментный анализ (ИФА), позволяющий выявить специфические иммуноглобулины классов М и G.

Выделение вирусов на культуре клеток до внедрения в практику молекулярно-биологических исследований считалось «золотым стандартом» этиологической расшифровки ОРВИ.

Модификацией культурального метода является Shell Vial Culture, при использовании которого результат получают за 24 часа. Анализируемые образцы центрифугируют с монослоем клеток, абсорбируют, а затем вносят моноклональные антитела к сверхранним и ранним белкам РСВ с последующей визуализацией полученных результатов в реакции иммунофлюоресценции. Метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью, однако имеет большую стоимость [21, 79].

Иммунофлюоресцентный метод очень часто используется для обнаружения РСВ. Прямой метод (ПИФ), где антиген обнаруживается с помощью меченных флуоресцентным красителем антител, также как и культуральный метод часто называют «золотым стандартом». [84, 173]. Реакция непрямой

иммунофлюоресценции (РНИФ), отличается использованием вторично меченных красителем антител (сначла к исследуемому материалу добавляются

специфические анти-РСВ IgG, которые связываются с антигенами РСВ, а затем антииммуноглобулиновая сыворотка, меченная красителем, которая связывается с соответствующими антителами и выявляется свечением под люминисцентным микроскопом).

В иностранной литературе описано много методик, основанных на иммунохроматографическом методе. Самое распространенное - боковое проточное иммунологическое исследование (lateral flow immunoassay - LFIA). Основано на центробежном движении комплексов антиген-антитело на специальной поверхности в «тестовую область», где фиксированы специфические анти-РСВ. Достижение этой области приводит к формированию цветного свечения, указывающего на присутствие антигена в исследуемом материале [171]. Некоторые модификации LFIA могут включать коллоидное золото, связанное со специфическими моноклональными антителами к РСВ. Это делается для того, чтобы связать антиген РСВ и с помощью золота добиться специфического (розового) свечения. Чувствительность и специфичность выше 90 и 95 %, соответственно. Время получения результатов не превышает получаса. Данные системы из-за их простоты и быстроты получения результатов используются во

время эпидемического подъема заболеваемости чаще у детей. Минусом является большая частота ложноотрицательных результатов у иммунодефицитных лиц [101, 125].

Классическая ПЦР сегодня является самым распространенным видом исследования, которое позволяет быстро и с высоким качеством произвести этиологическую расшифровку респираторной инфекции [126]. РСВ зачастую трудно диагностируется из-за малой вирусной нагрузки, особенно у взрослых пациентов, у пациентов с иммунодефицитом, при взятии материала для исследования через 2-3 дня от начала заболевания, поэтому чувствительность методов, основанных на выявлении антигенов и антител вируса ниже [86]. Метод основан на реакции обратной транскрипции (RT-PCR - reverse transcription polymerase chain reaction) в «гнездовой» ПЦР с использованием праймеров к F гену РСВ. Исследование занимает по времени не более 2 дней, а чувствительность достигает 73-80 %, что значительно лучше по сравнению с культуральным методом [116, 128, 145]. Одной из модификаций его является ПЦР в режиме реального времени или количественная ПЦР (Real Time PCR, Q-PCR), где для выявления РСВ используются праймеры и зонды к нуклеокапсидному гену (N). Весомыми преимуществами перед RT-PCR являются высокая чувствительность и специфичность (до 100 %), возможность типирования РСВ-A и РСВ-B, определение вирусной нагрузки [140], низкая пороговая чувствительность (при исследовании мазков из ротоглотки составляет 0,023 PFU (plaque forming unit - количество вирусных частиц) или 2 копии мРНК (матричная рибонуклеиновая кислота) для РСВ-A и 0,018 PFU или 9 копий мРНК для РСВ-B), высокая скорость получения результатов (3,5-4 часа), лучшая информативность при использовании у иммунокомпрометированных пациентов [39, 59, 69, 178].

Основным отличием мультиплексной ПЦР от вышеперечисленных методик является возможность одновременного определения до 18 респираторных вирусов в одном мазке из ротоглотки [68]. А с учетом большого количества микст- инфекций у детей первых 5 лет жизни (до 50 %) этот метод становится наиболее предпочтительным [59, 195]. Кроме того, он характеризуется высокой пропускной

способностью, относительной простотой постановки реакции, полной автоматизацией процесса, оптимальным соотношением цены, качества и информативности, а также использованием закрытой системы детекции, которая полностью исключает контаминацию.

Иммуноцитохимический метод основан на проведении специфических химических реакций с целью нахождения различных веществ. Для выявления антигена РСВ используются специфические моноклональные мышиные антитела. Метод изучает локализацию и оценивает количество выявляемого антигена в клетках (полуколичественно). В каждом мазке просматривается не менее 100 клеток в одном поле зрения. При нахождении более 5 % лимфоцитов, содержащих антиген, результат считается положительным. Для оценки полученных результатов используется метод Астальди, с помощью которого регистрируется интенсивность свечения выявленных комплексов антиген- антитело и выражается это следующим образом: «+» - слабоположительная реакция, «++» - положительная, «+++» - резко положительная [30, 41, 114, 115].

Доказано, что РСВ может персистировать в организме хозяина, а циркулирующие антитела после перенесенной инфекции не всегда предотвращают развитие повторных инфекций или активацию персистирующей инфекции. У иммунодефицитных пациентов и детей первых лет жизни иммунный ответ может запаздывать, вследствие чего IgM- и IgG-антитела могут не выявляться или определяться в незначительных концентрациях. Кроме того, многие авторы отмечают выделение вирусной РНК при полном отсутствии клинических симптомов заболевания. Все эти факты не позволяют в полной мере доверять серологическим и молекулярно-биологическим методам, так как они часто не позволяют дифференцировать острую, персистирующую или перенесенную инфекции. ИЦХ позволяет определять антигены респираторных и герпетических вирусов в лимфовзвеси крови или в эпителиальных клетках

носоглотки, имеет высокую специфичность, а также выявляет активность патологического процесса по количеству измененных клеток и выраженности их поражений [13, 20, 27, 50].

Основой иммуноферментного анализа является ферментативная реакция, способствующая калориметрическому определению комплексов антиген- антитело.

В зарубежной литературе описано много перспективных методов исследования, которые пока не имеют широкого применения в повседневной клинической практике. Примером является оптическое иммунологическое исследование (optical immunoassay - OIA), которое основано на прямой визуализации комплексов антиген-антитело, с помощью закрепления их на специальной отражающей поверхности. Эти комплексы формируют тонкий слой,

который изменяет отражающие свойства этой поверхности [201]. Метод прост, высокочувствителен (87,9 %) и высокоспецифичен (99,6 %), позволяет достаточно быстро выявить антитела к РСВ в концентрации 1 нанограмм/мл [130], однако рекомендуется, чтобы отрицательные результаты были сопоставлены с данными других тестов [32].

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) чаще используется для выявления нуклеиновых кислот РНК-вирусов, где требуется дополнительный синтез кДНК в реакции обратной транскрипции (RT-LAMP). При использовании мультиплексной LAMP (M-LAMP) для диагностики РСВИ пороговая чувствительность равна 10 копиям РНК, высока скорость получения результатов (от 30 минут до 1,5 часов). Метод позволяет типировать РСВ-A и РСВ-B, одновременно выявлять несколько респираторных вирусов в одном клиническом образце, определять вирусную нагрузку [70, 108]. При выявлении РСВ в мазках из ротоглотки метод обладает большей чувствительностью, чем культура клеток, ИФА и иммунохроматографическое исследование, однако уступает Real Time PCR [72, 200].

Микрочипирование - новое направление в лабораторной диагностике. Микрочипы это маленькие пластины, на которых закреплено огромное количество молекул ДНК/РНК различных микроорганизмов. Обнаружение гибридизации соответствующей ДНК/РНК позволяет идентифицировать микроорганизмы, находящиеся в исследуемых образцах [100]. Выгодность такого подхода продемонстрирована при одновременном определении РСВ, риновирусов, парагриппа, полиовирусов и аденовирусов [124]. Самый известный пример - «Virochip», который используется для одновременного обнаружения многих вирусов, и имеет сопоставимую чувствительность и специфичность по сравнению с общепринятыми методами [94, 194]. Исследование повторяет этапы RT-PCR, а гибридизация нуклеиновых кислот метится флуоресцентным красителем [67, 132, 192, 205]. Обширное наблюдение во время пандемии атипичной пневмонии 2002 г. показало высокую чувствительность и специфичность (более 90 %) данного метода [172]. Таким образом, у этой

системы есть огромный потенциал, который может использоваться в эпидемиологических исследованиях для проведения скрининга вирусных инфекций.

Масс-спектроскопия становится сегодня более востребованным методом молекулярного исследования болезнетворных микроорганизмов, поскольку имеет высокую надежность и дает точную информацию о последовательности нуклеиновых кислот [45]. Есть несколько модификаций этого метода [103], но самым подходящим для практического обнаружения РСВИ и других респираторных вирусов является масс-спектрометрия с ионизацией и электрораспылением (electrospray ionization mass spectrometry - ESI-MS) [61, 163]. Однако практическое применение этого метода целесообразно вместе с рутинной RT-PCR. Преимуществами исследования является мультиплексная детекция РСВ, гриппа A и B, парагриппа 1-4 типов, аденовирусов типов A-F, коронавирусов, человеческих бокавирусов и метапневмовирусов, высокая точность (87,9 %) и чувствительность, превышающая таковую при культуральном исследовании [91, 142, 192, 204].

Иммуно-ПЦР сочетает в себе комбинацию двух методов: ИФА и ПЦР. Исследование используется для обнаружения вирусных и бактериальных инфекций с низкой антигенемией, причем пороговая чувствительность составляет 10^-21 зептомолей [129]. Для выявления РСВ в исследуемом материале используется модификация иммуно-ПЦР с наночастицами золота и магнитными микрочастицами, которые вазаимодействуют с антителами к РСВ, чтобы связать его антиген. Данная методика позволяет определять РСВ даже в концентрации 4,1 PFU/mL, что в 4000 раз эффективнее ИФА и в 4 раза эффективнее классического RT-PCR [66].

РНК визуализация живых клеток основана на использовании ДНК зондов с комплементарными концевыми последовательностями, позволяющими определять мРНК РСВ [76]. Концевые последовательности комплементарны между собой, а флюорофор и гаситель соединены с концевыми нуклеотидами. При отжиге свободные зонды образуют ДНК «шпильки» за счет

комплементарных участков. При этом флюорофор и гаситель оказываются рядом друг с другом, что гасит флуоресцентный сигнал [10]. На основе этого метода разработана новая модель, где наночастицы золота присоединены к концевым нуклеотидам ДНК «шпилек» в качестве гасителя. Шпильки подбираются таким образом, чтобы они имели комплементарные последовательности к искомой РНК. 5'конец зонда связан с наночастицами золота, а 3'конец - с флюорофорой. При гибридизации искомой РНК с ДНК «шпилькой» гаситель оказывается пространственно отделен от флюорофора и определяется рост флуоресцентного сигнала. Этот механизм был предложен для обнаружения мРНК РСВ в культуре клеток ИБР-2 [95]. Техника обладает преимуществом одновременного

обнаружения в реальном времени множества мРНК, включая мРНК РСВ и GAPDH клеток HEp-2. Такой метод может обнаружить 11,9 PFU РСВ, что в 200 раз чувствительнее ИФА.

Описана методика определения РСВ с помощью квантовых точек - специальных флюоресцентных наночастиц неорганического характера, которые менее восприимчивы к метаболическому расщеплению, устойчивы к воздействию ультрафиолета, поэтому они не теряют способность к свечению при длительной выдержке на свету. РСВ выращивается на клеточной линии HEp-2, с последующей визуализацией F и G белков с помощью софокусной микроскопии и квантовых точек. Оказалось, что метод более чувствительный, чем ПИФ и Real Time PCR, особенно на ранней стадии заболевания [43, 141]. Иногда для диагностики РСВИ используют микрокапиллярную проточную цитометрию (интегрированную со стационарным софокусным микроскопом), при этом связанные с квантовыми точками антитела, помогают обнаруживать вирус быстро и с высокой чувствительностью [121, 144].

Таким образом, по данным литературы вклад РСВ в этиологическую структуру ОРВИ отличается не только у пациентов разного возраста, но и в разные эпидемические сезоны, в разных странах и регионах. Некоторые исследователи отмечают, что вирус является самой частой причиной ОРВИ у детей всех возрастов, другие выявляют его чаще у детей первого года жизни. До

сих пор не существует единого мнения о причинах различия сезонности РСВИ в разных странах и регионах, а все ученые приходят к заключению, что для выяснения ее локальных особенностей нужно проводить многолетние эпидемиологические наблюдения на данной территории. Кроме того, в отечественной литературе отсутствуют публикации, посвященные сравнительной оценке клинической картины заболевания у пациентов различного возраста. А это является принципиальным вопросом, так как ранняя диагностика РСВИ важна для быстрой оценки и прогнозирования тяжести заболевания, проведения дифференциальной диагностики с бактериальными инфекциями, назначения своевременной этиотропной терапии, предотвращения нозокомиального распространения инфекции путем изоляции пациентов в боксах с учетом этиологии заболевания [1, 31]. К тому же в диагностику респираторных инфекций прочно входит иммуноцитохимический метод, базирующийся на использовании высоко специфических моноклональных антител к определенным белкам вируса, однако данных о его использовании при РСВ-инфекции нет. Также в отечественной и в зарубежной литературе отсутствуют публикации о диагностической эффективности ИФА и ИЦХ у детей различного возраста. Несмотря на множество исследований по фармакоэкономической эффективности применения паливизумаба для профилактики тяжелого течения РСВИ у детей первого года жизни из групп риска за рубежом, в нашей стране таких исследований не проводили. Поэтому изучение локальных эпидемиологических особенностей, различий в клинико-лабораторной диагностике у детей разного возраста, а также фармакоэкономической целессобразности проведения специфической иммунопрофилактики РСВИ на сегодняшний день имеет большую актуальность.