Диагностика респираторно-синцитиальной вирусной инфекции с помощью полимеразной цепной реакции

С целью выявления РНК респираторно-синцитиального вируса человека методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией использовали набор реагентов «АмплиСенс® hRSV-FL» формат FRT, форма 2 (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия).

• комплект реагентов для экстракции РНК из клинического материала «РИБО-преп» вариант 50 (ТУ 9398-071-01897593-2008), который содержит раствор для лизиса, раствор для преципитации, растворы для отмывки, РНК-буфер (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия);

• реактивы для реакции обратной транскрипции для получения кДНК на матрице РНК «РЕВЕРТА-L» вариант 50 (ТУ 9398-005-01897593-

2008), куда входят RT-G-mix, RT-mix, ревертаза (MMlv) и ДНК-Буфер (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия);

• комплект для амплификации кДНК РСВ «ПЦР-комплект» вариант FRT (ПЦР-смесь-1-FEP/FRT hRSV, ПЦР-смесь-2-FL, ПКО кДНК hRSV-Flu, ПКО STI-88, ТЕ-буфер) (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия).

Кроме того, для реакции обратной транскрипции, амплификации и гибридизационно-флуоресцентной детекции продуктов амплификации требуется программируемый амплификатор с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени» Rotor-Gene Q (Qiagen, Германия).

Исследовались мазки из ротоглотки. Методика взятия материала и оборудование не отличалось от таковых при использовании мультиплексной ПЦР. В комплекте реагентов применяется «горячий старт», который обеспечивается разделением нуклеотидов и Taq-полимеразы прослойкой воска. Плавление воска и перемешивание реакционных компонентов происходит только при 95 °С.

Анализ результатов проводили с помощью программного обеспечения амплификатора. Результаты оценивали по наличию/отсутствию пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, что определяет наличие/отсутствие для данной пробы кДНК значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов (прилагается в инструкции по применению метода). Положительной является проба, в которой в таблице результатов по каналу JOE/Yellow определено значение порогового цикла Ct, не превышающее значение 28, отрицательной - в таблице по каналу JOE/Yellow значение Ct не определено (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию), а по каналу FAM/Green значение Ct не превышает 30. Образец считается невалидным, если для него не определено значение Ct по каналу JOE/Yellow, и по FAM/Green значение С также отсутствует или превышает значение 30. В этом случае требуется повторно провести исследование с этапа экстракции РНК. Проба оценивается как сомнительная, когда в таблице результатов по каналу JOE/Yellow определено

значение Ct более 28, а по каналу FAM/Green значение Ct не превышает 30. При получении подобного результата также необходимо провести повторное исследование. Постановку всех молекулярно-биологических исследований проводили в отделе молекулярной микробиологии и эпидемиологии ФГБУ НИИДИ ФМБА России (руководитель отдела - д.м.н., профессор Сидоренко С.В.).

2.4