9.4. Выделение плазмидной ДНК.
Аналитические количества плазмидной ДНК выделяли двумя способами:
Первый способ представляет собой метод щелочного лизиса ночной культуры бактерий (Маниатис с соавт., 1988). После осаждения бактерий из 4 мл среды LB центрифугированием в течение 1 мин осадок ресуспендировали встряхиванием в 300 мкл охлажденного во льду раствора 1 для выделения плазмид и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре.
Затем добавляли 600 мкл свежеприготовленного раствора 2 (лизирующего) и осторожно перемешивали содержимое, переворачивая пробирку 4-5 раз без встряхивания. Выдерживали в ледяной бане в течение 5 мин. Далее добавляли 450 мкл охлажденного во льду раствора 3 (нейтрализующего) и осторожно перемешивали содержимое, переворачивая пробирку 4-5 раз без встряхивания. Инкубировали в ледяной бане в течение 5 мин. После этого центрифугировали при 13 тыс. об/мин в течение 5 мин при 4оС. Переносили надосадочную жидкость и добавляли к ней равный объем смеси фенол-хлороформ. Перемешивали в течение 2 мин интенсивным встряхиванием и центрифугировали в течение 2 мин. Затем к супернатанту добавляли равный объем хлороформа и повторяли процедуру. Далее осаждали ДНК двумя объемами этанола, выдержав в течение 5 мин при комнатной температуре, и центрифугировали при 13 тыс. об/мин в течение 10 мин при 4оС. Осадок промывали 75% этанолом на 1 STE, высушивали в вакуумном эксикаторе, растворяли в 50 мкл буфера ТЕ и обрабатывали РНКазой 20 мкг/мл.Второй способ представляет собой использование системы для выделения плазмид Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System ("Promega", США). Выделение проводили по протоколу, предложенному фирмой.
Количественную оценку плазмидной ДНК осуществляли спектрофотометрически. Сиквенс клонированного продукта ПЦР в составе вектора проводился на автоматическом сиквенаторе в институте Молекулярной биологии им. Энгельгардта, Россия.
Еще по теме 9.4. Выделение плазмидной ДНК.:
- ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ № 2 Тема: Выделение ДНК из крови
- Выделение бактериальной ДНК
- 4. Выделение ДНК из лейкоцитов.
- ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ №3 Тема: Выделение ДНК на сорбент из крови
- 3. Выделение ДНК и РНК из клеточных культур.
- ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ №4 Тема: Выделение ДНК из мочи, секрета простаты, слюны, глазной жидкости
- ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА №5 Тема: Аплификация образцов выделенной ДНК
- 10.1. Электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле.
- 2.3 Идентификация Candida spp. методом ДНК-секвенирования
- Репликация ДНК
- 5. Рестрикция геномной ДНК.
- Строение и функции ДНК
- Как избежать контаминации и деградации РНК и ДНК
- Распространение метилирования ДНК.
- Направленное клонирование фрагмента ДНК
- 13. Переосаждение ДНК (РНК).
- Нарушение механизмов репарации ДНК