10.1. Электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле.

Разделение ДНК проводили в горизонтальном агарозном геле в 1 ТАЕ в присутствии бромистого этидия. Геномную ДНК после обработки метил-чувствительными рестриктазами и плазмидную ДНК фракционировали в 0.8% агарозе; фрагменты ДНК, полученные в результате ПЦР, в зависимости от размера разделяли в 1-3% геле.

Соответствующее количество агарозы ("Sigma", США; "Serva", США) и буфера ТАЕ нагревали в дистиллированной воде до полного расплавления агарозы. После этого раствор агарозы охлаждали до 50оС и добавляли бромистый этидий до конечной концентрации 0.5 мкг/мл, перемешивали и заливали в кювету для геля. Образцы исследуемой и маркерной ДНК наносили в гель, предварительно смешав с буфером для нанесения (9:1, о/о). В качестве ДНК-маркера применяли X Hind III, X PstI и 100bp (табл. 3). Электрофорез геномной ДНК проводили при напряженности электрического поля

Таблица 3. ДНК-маркеры молекулярного веса.

Маркер	Источник ДНК	Рестриктаза	Фрагменты, тыс. п.о.
X PstI	фаг X	PstI	0.15 0.2 0.211 0.216 0.243 0.264 0.339 0.448 0.468 0.514 0.805 1.093 1.159 1.780 1.986 2.14 2.459 2.556 2.898 4.507 4.749 5.077 11.499
X HindIII	фаг X	HindIII	0.5 2.0 2.3 4.4 6.6 9.4 23.9
100 bp	исскуственный	—	0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

3-4 В/см в течение ночи. В дальнейшем фракционированную геномную ДНК переносили на нейлоновую мембрану и использовали в блот-гибридизации. Электрофорез плазмидной ДНК и продуктов ПЦР проводили при напряженности электрического поля 10-15 В/см в течение 30-45 мин. ДНК в геле регистрировали по флуоресценции в проходящем ультрафиолете с длиной волн от 240 нм до 360 нм. Результаты протоколировали с помощью фотографирования геля или системы Gel Imagertm.

<< | >>

↑

Источник: ПЕТРЕНКО АНАТОЛИЙ АНАТОЛЬЕВИЧ. Анализ метилирования ДНК при раке шейки матки. 2003

Еще по теме 10.1. Электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле.:

- Детская онкология - Кардиоонкология - Лечение онкологических заболеваний - Онкогастроэнтерология - Онконефрология - Паллиативная медицина -

- Акушерство и гинекология - Анатомия - Андрология - Биология - Болезни уха, горла и носа - Валеология - Ветеринария - Внутренние болезни - Военно-полевая медицина - Восстановительная медицина - Гастроэнтерология и гепатология - Гематология - Геронтология, гериатрия - Гигиена и санэпидконтроль - Дерматология - Диетология - Здравоохранение - Иммунология и аллергология - Интенсивная терапия, анестезиология и реанимация - Инфекционные заболевания - Информационные технологии в медицине - История медицины - Кардиология - Клинические методы диагностики - Кожные и венерические болезни - Комплементарная медицина - Лучевая диагностика, лучевая терапия - Маммология - Медицина катастроф - Медицинская паразитология - Медицинская этика - Медицинские приборы - Медицинское право - Наследственные болезни - Неврология и нейрохирургия - Нефрология - Онкология - Организация системы здравоохранения - Оториноларингология - Офтальмология - Патофизиология - Педиатрия - Приборы медицинского назначения - Психиатрия - Психология - Пульмонология - Стоматология - Судебная медицина - Токсикология - Травматология - Фармакология и фармацевтика - Физиология - Фтизиатрия - Хирургия - Эмбриология и гистология - Эпидемиология -