- 6 -Введение

Актуальность темы: Рак шейки матки занимает второе место среди всех онкологических заболеваний у женщин. Этиологическим фактором рака шейки матки (РШМ) признаны вирусы папиллом человека (HPV) из так называемой группы высокого риска (типы 16, 18 и другие).

В последнее десятилетие было установлено, что в многостадийном процессе образования опухолей нарушение функций клеточных генов может происходить не только в результате генетических событий (точечные мутации, делеции, амплификация и реарранжировка генов), но и в результате эпигенетических изменений, в том числе локального гиперметилирования ДНК. Аберрантному метилированию в опухолевых клетках подвергаются специфические последовательности - CpG-островки, ассоциированные с 5' регуляторными районами многих генов. В нормальных клетках большинство CpG-островков не метилировано, а их метилирование в опухолевых клетках, как правило, сопровождается подавлением транскрипции соответствующего гена, наследуемой при делении клетки. Механизмы инициации локального метилирования CpG-островков в опухолях пока не ясны.

В последнее время разработаны методы идентификации гиперметилированных районов ДНК, основанные на дифференциальном статусе метилирования CpG-островков в нормальных и опухолевых клетках. Во многих случаях с помощью этих методов были идентифицированы гены, инактивируемые в опухолях путем аберрантного метилирования ассоциированных с ними CpG-островков. Среди них обнаружены как новые гены, утрата функций которых оказалась существенной для развития опухолей, так и известные гены, подавление экспрессии которых в опухолях в отсутствии инактивирующих мутаций уже было продемонстрировано.

Цель настоящей работы: Идентификация гиперметилированных в опухолях шейки матки CpG-островков и ассоциированных с ними генов, экспрессия которых может быть подавлена вследствие нарушения метилирования ДНК.

Исходя из цели работы, были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1) Провести скрининг аберрантно-метилированных GC-богатых последовательностей ДНК в карциномах шейки матки методом метилчувствительной ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами, определить нуклеотидную последовательность обнаруженных GC-богатых фрагментов ДНК, выявить среди них CpG-островки.

2) Провести поиск в базах данных гомологий выявленных CpG-островков с известными последовательностями ДНК.

3) В случае отсутствия гомологий CpG-островка с известными последовательностями в базах данных, провести клонирование и определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК, фланкирующих CpG-островок для его локализации в геноме человека.

4) В случае установления ассоциации выявленных CpG-островков с генами, провести анализ статуса метилирования и экспрессии соответствующих генов в первичных опухолях и клеточных линиях карцином шейки матки.

Научная новизна и практическая ценность работы:

С помощью метода метилчувствительной ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами было выявлено 7 GC-богатых фрагментов ДНК длиной от 300 до 1200 пар оснований, пять из которых (более двух третей) обладают свойствами CpG-островков. Из пяти выявленных CpG-островков два оказались непредставленными в опубликованных версиях генома человека: фрагмент 26 был представлен неполностью (отсутствовала область, фланкирующая 5' конец гена /ЗА-адаптина), фрагмент 22 до сих пор отсутствует в опубликованных базах данных.

В работе впервые показано подавление экспрессии мРНК гена /ЗА-адаптина в клеточных линиях рака шейки матки.

Теоретическое значение работы заключается в получении новых данных об участии клеточных генов в механизме злокачественной трансформации под действием вирусов папиллом человека. Обнаруженное подавление экспрессии гена /ЗА-адаптина в клетках карцином шейки матки указывает на необходимость дальнейшего исследования роли белковых комплексов, вовлеченных в эндо/экзоцитоз белков, в канцерогенезе. Показана возможность идентифицикации CpG-островков, до сих пор не представленных в опубликованных версиях нуклеотидных последовательностей генома человека, с помощью метода метилчувствительной ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами, что позволяет получить информацию о GC-богатых трудноклонируемых районах генома человека.

- 9 -