1.1. Принцип метода метилчувствительной ПЦР со статистическими GC- богатыми праймерами.

Задачей нашего исследования было обнаружение CpG-островков, метилированных в опухолях шейки матки. Для ее решения мы использовали метод метилчувствительной ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами (СП-ПЦР) (Gonsalgo et al.

-продукт ПЦР первого типа; - продукт ПЦР второго типа. Числами справа указаны размеры маркерных фрагментов.

- 63 -

ферментами, содержащимися в полилинкере. Вслед за этим проводили сиквенс клонов.

После секвинирования был проведен анализ полученных последовательностей. Во-первых, исследуемые фрагменты локализовывали в геноме человека. При отрицательном результате поиск проводили в геномах других позвоночных. Для решения этой задачи мы использовали набор программ поиска гомологий BLAST® (см. раздел "Материалы и методы", п. 14.1). Во-вторых, необходимо было установить, является ли обнаруженная нами последовательность CpG-островком. Для этого мы использовали общепринятые критерии CpG-островков (см. раздел "Материалы и методы", п. 14.2).

Результаты анализа выявленных фрагментов представлены на рисунке 10 и в таблице 4.

Фрагмент 18 локализован во втором интроне гена LOC148870, расположенного на первой хромосоме в зоне 1p36.32 (Homo sapiens chromosome 1 reference genomic contig NT 004321, www.ncbi.nlm.nih.gov/ entrez/viewer.fcgi?val=NT_004321.12). Данный ген получен автоматическим компьютерным анализом с использованием метода предсказания BLAST.

Фрагмент 30 расположен в локусе AL137850 девятой хромосомы в зоне 9q31.3-33.3 (Homo sapiens chromosome 9 reference genomic contig NT_017568, www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val=NT_017568.10). Данный фрагмент также представляет собой просто GC-богатую последовательность.

Фрагмент 22. В базах данных не обнаружено последовательности гомологичной этому фрагменту. При этом анализ указывает на его

* Идентификационный номер в GenBank: 22 - AF218212, 26 - AF247736

** В случае фрагментов 26, 32, 34 и 36 данный показатель приведен для всего CpG островка

*** Полный размер CpG островка указан на основании гомологии в случае фрагмента 34 с геном LOC254722, в случае фрагмента 36 с 3.3-kb повтором, в случае фрагмента 26 после определения нуклеотидной последовательности 5' регуляторного района гена вЗА-адаптина

принадлежность к CpG-островку. Обращает на себя внимание, что из всех выявленных нами CpG-островков фрагмент 22 обладает наиболее высокой плотностью CpG динуклеотидов (63 на 563 п.н.).

Фрагмент 32 расположен в локусе AL137058 на тринадцатой хромосоме в зоне 13q32.2-33.3 (Homo sapiens chromosome 13 reference genomic contig NT 024524, www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val= NT 024524.10). Данная последовательность окружена с двух сторон повторами MER21B - 5' и AluSx - 3', а сам фрагмент гомологичен CpG-островку, который в свою очередь был выявлен с помощью компьютерного анализа (Sanger Centre Chromosome 13 Mapping Group, http://www.sanger.ac.uk/HGP/Chr13), однако ген, ассоциированный с этим CpG-островком, не определен.

Фрагмент 34 был выявлен при клонировании фрагмента 32, по-видимому, в качестве незначительной примеси, неотделившейся даже в денатурирующих условиях при электрофорезе в ПААГе, предположительно за счет высокого содержания GC пар в обоих фрагментах. Местоположение фрагмента 34 в геноме - 3' область гена LOC254722, расположенного на хромосоме Х (Homo sapiens chromosome X reference genomic contig NT 011786, www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ viewer.fcgi?val=NT_011786.10), полученного компьютерным анализом с использованием метода предсказания GenomeScan. Существование данного гена подтверждается гомологией с одним клоном EST. Фрагмент 34 содержит в своем составе часть последовательности CpG-островка, который включает в себя конец последнего интрона, последний экзон гена и нетранскрибируемую межгенную последовательность.

Фрагмент 36. При анализе нуклеотидной последовательности этого фрагмента было установлено, что он гомологичен близкородственным друг другу областям с тандемными 3.3-kb повторами, располагающимся в прителомерных областях хромосомы 10 (зона 10q26.3) и хромосомы 4 (зона 4q35, полиморфный район D4Z4). Так в локусе D4Z4 обнаруживают от 10 до

- 68 -

100 тандемных 3.3-kb повторов. Каждая копия повтора содержит ген DUX4, относящийся к семейству генов DUX, кодирующих транскрипционные факторы с двумя гомеодоменами (Gabriels et al. 1999). Для локуса 10q26.3 хромосомы 10 на данный момент выявлен набор гипотетических генов, имеющих предсказанную компьютерным анализом пептидную структуру, подобную гомеобоксным белкам. По своим параметрам 3.3-kb повтор обладает свойствами CpG-островка (Access. No HUMFSHD http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&lis t_uids=00871846&dopt=GenBank) и принадлежит к семейству 3.3-kb повторов, ассоциированному с областями гетерохроматина. Кроме прителомерных областей хромосом 4 и 10 члены этого семейства располагаются на коротком плече всех акроцентричных хромосом и в перицентромерной области хромосомы 1 (см.

Фрагмент 26. При поиске гомологий с известными последовательностями выяснилось, что первые 127 н.п. (фрагмент А, рис. 11) имеют гомологию с 5' концом кДНК гена вЗА-адаптина (AP3B1: adaptor-related protein complex 3, beta 1 subunit). Следующие 93 н.п. (фрагмент Б) не имели гомологий с известной последовательностью, а последние 45 н.п.

1 экзон 1 интрон 2 экзон

H Sc H N Sc H

CpG островок -4—26-3 100 п.н.

Рисунок 11. Схематическое изображение расположения относительно друг друга первого экзона гена вЗА-адаптина, фрагмента 26 и ранее обнаруженного CpG островка (Cross et. al., 1994). Вертикальная черта обозначает местоположение сайтов метилчувствительных рестриктаз: H - HpaII; Sc - ScaII; N - Narl;

- фрагмент А,ЕЭ - фрагмент Б,ЕЭ - фрагмент В, — - неизвестная последовательность. Стрелками обозначены праймеры.

(фрагмент В) перекрываются с последовательностью, которая ранее была обнаружена другим методом как CpG-островок (Cross et al. 1994).

Нахождение фрагмента 26 и этого CpG-островка в составе единой последовательности мы подтвердили получением общего продукта амплификации ДНК из клеток HeLa с помощью праймеров 26-1 и 26-3 и его последующим секвенированием. Так как на тот момент была известна только кДНК этого гена, и отсутствовал полный сиквенс ДНК этого района, из полученных результатов следовало, что фрагмент А является частью первого экзона, а фрагмент Б и ранее обнаруженный CpG-островок представляют собой начало первого интрона. Сопоставление нуклеотидных последовательностей выделенного нами фрагмента ДНК и кДНК гена показало, что в состав первого экзона входят 220 н.п., далее следует канонический донорный сайт сплайсинга (GT), а следующие 362 н.п. не имеют гомологии с последовательность кДНК и представляют начало первого интрона. После появления и аннотирования в базах данных полной последовательности ДНК гена (Homo sapiens chromosome 5 reference genomic

contig NT_006713,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val=NT_006713.10) оказалось, что размер первого экзона действительно составляет 220 н.п., а первый интрон начинается с установленной нами последовательности и имеет длину 26856 н.п.

Несмотря на небольшую длину, фрагмент 26 обладает свойствами CpG-островка (значение Н/Т составляет 0.78, содержание GC равно 0.59). Также он оказался ограничен с обеих сторон сайтом SacII. Данный фрагмент был выявлен с помощью статистического праймера СП-2, который имеет на 3' конце последовательность сайта SacII. Действительно, в 5' области гена вЗА-адаптина имеется зона, где два сайта SacII расположены на расстоянии 275 п.н., и именно эта зона и была амплифицирована. С другой стороны анализ показал, что CpG-островок не ограничен рамками фрагмента 26. Из исследований параметра Н/Т и GC-состава следует, что в его состав входят весь первый экзон и начало первого интрона. С 3' конца он ограничен повтором HERVK14CI. На основании этого можно сделать вывод, что CpG-островок гена вЗА-адаптина заканчивается в первом интроне. Из-за отсутствия полной последовательности ДНК гена вЗА-адаптина невозможно было определить, продолжается ли CpG-островок в 5' регуляторную зону. Это было сделано экспериментально (см. ниже).

Таким образом, все семь фрагментов ДНК, выявленных методом СП-ПЦР, оказались GC-богатыми последовательностями, а пять из них CpG-островками. При этом они являются CpG-островками, не только по общепринятым критериям, но и по предложенным в последнее время критериям, которые позволяют исключить GC-богатые Alu-повторы: размер последовательности более 500 н.п., GC состав более 0.55, отношение экспериментально определенного числа CpG динуклеотидов к теоретически возможному (показатель Н/Т) более 0.65 (Takai and Jones, 2002). Обращает на себя внимание тот факт, что среди пяти отобранных CpG-островков не оказалось последовательностей, ассоциированных с Alu-повторами, эндогенными провирусами и рибосомальными генами. Возможно, что отсутствие такого типа CpG-островков связано с непременным условием отбирать только те CpG-островки, которые изменяли статус метилирования в опухолевых клетках по сравнению с нормальными. Отбор дифференциально-метилированных CpG-островков проводили на небольшом числе парных образцов (группы из 7 и 8 пар образцов). Анализ реального статуса метилирования в относительно большом числе опухолей и двух клеточных линиях карцином шейки матки был проведен для CpG-островков 32 и 26.