ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.................................................................................................. 5

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................................

МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК................................................................................................... 9

Распространение метилирования ДНК............................................................................... .... 9

Функция метилирования ДНК............................................................................................... 12

Метилирование во время развития....................................................................................... 13

Ферменты метилирования...................................................................................................... ... 15

Метилирование как динамический процесс...................................................................... .... 17

Роль метилирования в канцерогенезе................................................................................. 20

Генетическая роль метилирования ДНК в канцерогенезе.............................................. .... 22

Эпигенетическая роль метилирования ДНК в канцерогенезе....................................... 23

Сравнительный анализ современных методов определения статуса

метилирования ДНК................................................................................................................. 33

Методы анализа статуса метилирования CpG динуклеотидов.................................. 33

Методы идентификации CpG-островков, аберрантно-метилированных в

опухолях...................................................................................................................................... ... 35

Заключение................................................................................................................................

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ................................................................................................. ... 38

1. Список использованных реактивов................................................................................. .... 38

2. Клинические материалы.................................................................................................... .... 40

3. Выделение ДНК и РНК из клеточных культур.............................................................. 41

4. Выделение ДНК из лейкоцитов........................................................................................ 41

5. Рестрикция геномной ДНК................................................................................................. 42

6. Бисульфитная модификация ДНК.................................................................................... 43

7. Полимеразная цепная реакция......................................................................................... .... 43

7.1. Праймеры........................................................................................................................... 43

7.2. Метилчувствительная ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами 45

7.3. Метилчувствительная ПЦР со специфическими

праймерами............................................................................................................................... .... 46

7.4. Метилспецифическая ПЦР............................................................................................. 46

8. Выделение продуктов ПЦР из гелей............................................................................... 47

8.1. Выделение продуктов ПЦР из полиакриламидного геля........................................ .... 47

8.2. Выделение продуктов ПЦР из агарозного геля......................................................... .... 47

9. Клонирование продуктов ПЦР..........................................................................................

9.1. Вектор................................................................................................................................ 47

9.2. Получение компетентных клеток Escherichia coli.................................................. ... 48

9.3. Трансформация клеток Escherichia coli..................................................................... ... 49

9.4. Выделение плазмидной ДНК........................................................................................... 49

10. Гель-электрофорез............................................................................................................ 50

10.1. Электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле................................... ... 50

10.2. Электрофоретическое разделение РНК в агарозном геле................................... 51

10.3. Электрофорез ПЦР-амплифицированной ДНК в денатурирующем полиакриламидном геле 52

11. Блот-гибридизация............................................................................................................ .... 53

11.1. Перенос ДНК на нейлоновую мембрану.................................................................... 53

11.2. Перенос РНК на нитроцеллюлозную мембрану...................................................... .... 53

11.3. Получение меченого зонда........................................................................................... 54

11.4. Гибридизация ДНК (РНК), иммобилизованной на мембране............................... 54

12. Обратная транскрипция................................................................................................... .... 55

13. Переосаждение ДНК (РНК)............................................................................................. 55

14. Анализ нуклеотидных последовательностей.............................................................. ... 55

14.1. Поиск гомологий в банках данных.............................................................................

14.2. Критерии CpG-островков........................................................................................... ... 56

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ................................................................................... .... 57

1. Поиск CpG-островков, гиперметилированных в опухолях шейки матки................ ... 57

1.1. Принцип метода метилчувствительной ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами 57

1.2. Анализ фрагментов, выявленных с помощью метилчувствительной ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами 63

1.3. Определение статуса метилирования CpG-островка 32 при раке шейки матки 70

1.4. Определение полного размера CpG-островка гена вЗА-адаптина.................................................................................... 72

2. Исследование экспрессии и статуса метилирования гена (ЗЗА-адаптина при раке шейки матки.............................................................................................................. 76

2.1. Исследование экспрессии мРНК гена вЗА-адаптина в опухолях шейки матки и в клеточных линиях рака шейки матки 76

2.2. Изучение статуса метилирования CpG-островка гена вЗА-адаптина в

опухолях шейки матки и в клеточных линиях рака шейки матки................................ 78

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ...................................................................................... 86

ВЫВОДЫ............................................... 94

ЛИТЕРАТУРА........................................... 95

- 5 -