Методы анализа статуса метилирования CpG динуклеотидов.

Применение метилчувствительных эндонуклеаз рестрикции. Для анализа статуса метилирования CpG динуклеотидов, находящихся в сайте узнавания, часто используют пары рестрикционных эндонуклеаз, являющихся изошизомерами и различающихся по чувствительности к метилированию остатков цитозина (например, пары HpaII и Mspl, TaqI и Sau3A, Smal и Хит!).

Картирование метилированных цитозиновых остатков в известной последовательности ДНК (Clark et al. 1994). Метод основан на превращении всех неметилированных остатков цитозина в остатки урацила в результате обработки ДНК бисульфитом натрия. При этом цепочки ДНК оказываются в участках модификации некомплементарными друг другу. Амплификация исследуемой последовательности с помощью ПЦР и последующее стандартное секвенирование выявляют как цитозин только те цитозиновые остатки, которые в исходной цепочке были метилированы. Преимуществом данного метода является возможность установить статус метилирования каждого CpG динуклеотида в исследуемой последовательности ДНК. Высокая чувствительность метода позволяет исследовать статус метилирования отдельных генов в раннем эмбриональном развитии (на стадии двух клеток), а также выявлять те динуклеотиды CpG в составе CpG-островков, метилирование которых необходимо и достаточно для подавления транскрипции соответствующего гена (Walsh and Bestor 1999; Warnecke et al. 1998; Cote et al.

MSP (methylation-specific PCR) - метод, позволяющий оценивать статус метилирования группы близкорасположенных CpG динуклеотидов в составе CpG-островка. Его большим достоинством является высокая чувствительность, позволяющая анализировать метилированные аллели в присутствии большого избытка аллелей дикого типа (1 метилированный аллель на 1000 неметилированных; Herman et al. 1996), и возможность быстро проводить анализ большого числа образцов. Как и в предыдущем методе, процедура состоит в предварительной обработке исследуемых ДНК бисульфитом натрия. Для амплификации модифицированной ДНК конструируют праймеры, избирательно амплифицирующие

последовательности, содержащие или метилированные, или неметилированные остатки цитозина. Данный метод позволяет проводить скрининг статуса метилирования определенных CpG динуклеотидов в составе CpG-островка исследуемого гена в опухолях различной локализации.

Таким образом, если метод картирования метилированных цитозиновых остатков в известной последовательности ДНК позволяет обнаружить CpG динуклеотиды, необходимые и достаточные для инактивации транскрипции определенного гена, то метод MSP можно использовать для быстрого исследования статуса метилирования этих CpG динуклеотидов и, соответственно, функциональной активности соответствующего гена, в различных опухолях.