Получение бета-ЦД методами контролируемой конверсии

Существует много подходов, направленных на увеличение выхода одного из циклических дек­стринов (альфа-, бета- или гамма-) в процессе ферментативной трансформации крахмала. Уже классическими считается методы контролируемой конверсии, основанные на введении в реак­ционную смесь специально подобранных органических соединений.

Согласно принципу Ле-Шаталье, вывод из системы продуктов обратимой реакции способствуют образованию их новых порций. Сказанное целиком относится к ферментативному синтезу цик­лодекстринов в присутствии сольвентов. Образовавшиеся циклические декстрины тут же связыва­ются в форме нерастворимых комплексов (выводятся из реакционной системы) и не мешают обра­зованию новых порций этих продуктов. Осадок комплекса, накапливающийся в конверсионной смеси, может быть легко отделен фильтрованием (центрифугированием), а затем подвергнут термическому разложению до циклодекстринов и комплексообразователей.

В случае высокой селективности растворителя, т.е. его способности «выводить» из реакционной смеси только один гомолог ЦД, степень превращения крахмала в требуемый продукт возрастает в значительной степени, иногда даже мало зависящей от «специфичности» используемой ЦГТазы. Например, для получения бета-циклодекстрина уже может быть использован препарат альфа- ЦГТазы из Paenibacillus macerans. Наиболее удачными для контролируемого синтеза бета-цикло- декстрина является сочетание бета-специфичной ЦГТазы со специфичным растворителем, что позволяет достичь очень высоких показателей конверсии (до 80-85 %).

В качестве комплексообразователя, способствующего образованию бета-циклодекстрина, используется такое органическое вещество как толуол, наиболее подходящее для образования ком­плекса именно с этим циклическим сахаром.

одбору растворителей, селективно влияющих на выход одного из трех циклических продук-

’ ^значительное внимание было уделено еще в начале 1970-х годов. Помимо толуола, повышаю-

щего выход бета-циклодекстрина, в ряду длинного списка изученных органических комплексооб­разователей был, в частности, обнаружен дециловый спирт, или деканола-1, способствовавший ферментативному образованию альфа-циклодекстрина при одновременном использовании ЦГТазы из Р. macerans. Позднее были найдены специфические осадители гамма-циклодекстрина. Все они представляли собой объемные симметричные углеводородные циклы или комбинации различных веществ.

Учитывая, что бета-циклодекстрин является наиболее востребованным, задача организации его крупнотоннажного синтеза всегда стояла на первом месте. Попытки практического использования контролируемой конверсии нашли свое воплощение, в частности, в «венгерской технологии» бета- ЦД реализованной в промышленном масштабе фирмой «Chinoin» (1980-1990) . В качестве комп­лексообразующего агента, был выбран толуол, хорошо решавший проблемы экономического характера, но одновременно, снижавший качество готового продукта.

В начале 1990-х годов в России (Институт биологии Уфимского научного центра РАН) была построена пилотная установка модульного типа для получения бета-циклодекстрина (рис. 14). Процесс был организован в периодическом режиме, и одни и те же аппараты использовались в раз­личных целях. В основу процесса были положены принципы сольвентно-контролируемой конвер­сии. В качестве комплексанта, альтернативного толуолу, был выбрав значительно менее ток-

Рис. 14. Технологическая схема пилотной установки по получению бета-циклодекстрина (Институт биологии Уфимского Научного Центра РАН, 1994)

Реактор — Главный реактор 1 м3 с рубашкой; СК 1 — сборник парового конденсата; СЦ I — сборник циклогексана; Н1 и Н2 — насосы; В — воронка; Л — люк реактора; НФ — путч — филътр;

XI, Х2 — кожухотрубчатые теплообменники; С — слив отработанной воды (конденсата);

К — кислый конденсат; ВС-1 — вакуумная сушилка; ВКН — вакуумный водокольцевой насос;

КР — кристаллизатор; Сб-1 промежуточная емкость;

ВВ-1 —вакуум-выпарное устройство

„ „ Потслодекстрины: биотехнология и применение _______________________________________________________________

уеаксмп-*_♦------- —------------------------------------ ■----

йй и доступный циклогексан. Учитывая, тот факт, что циклогексан, одинаково хорошо взаи- ^Ctl4HficTByeT и с альфа- и с бета-циклодекстрином, было принято решение использовать его в соче- ^М0Дии С бета-ЦГТазой штамма Bacillus sp. ИБ-663, выделенного в Институте биологии Уфимского Очного центра РАН.

была типичной для всех сольвентных технологий.

Через воронку «В» суспензию картофельного крахмала, (20-25 % масс.), взвешенную в хо­

лодной воде, подавали с небольшой скоростью в биохимический реактор 1 м⁸, на 10-15 % запол­ненный при помощи насоса Н2 (из 1200 литрового сборника СК-1) паровым конденсатом. Перед подачей крахмальной суспензии воду в реакторе разогревали до 75 С. Реактор из нержавеющей стали был снабжен лопастной мешалкой, нагревательной рубашкой и перемешивающим устрой­ством с редуктором. В состав крахмальной суспензии вводили ЦГТазу B.sp ИБ-663 в концентра­ции, достаточной для ожижения 20 % -ного картофельного клейстера. Нативный крахмал при попадании в горячий раствор превращался в клейстер, в результате чего, повышалась его вяз­кость. Одновременно вступал в действие фермент, деполимеризующий крахмал (ЦГТаза), после чего вязкость жидкости в реакторе снижалась. Скорость подачи свежих порций суспензии крах­мала в главный реактор устанавливали таким образом, чтобы процесс заполнения емкости про­ходил в изотермическом режиме и вязкость клейстера не превышала критических значений. После подачи последних порций субстрата реакционную смесь выдерживали при 75 С 20—30 мин, после чего прогревали полученный раствор до 98 С.

После охлаждения «ожиженного» клейстера до рабочей температуры 55 °С в него вводили рассчитанную дозу раствора рабочего фермента (ЦГТазы Bacillus sp. ИБ-663), полученного ранее в виде сухого ферментного препарата ГЗХ на Приволжском биохимическом комбинате. Смесь дополнительно перемешивали в течение 2—6 ч, после чего к полученной жидкости добавляли рас­считанное количество комплексообразователя- циклогексана. Реактор герметизировали и про­должали реакцию еще 48 ч при 55 "С, контролируя ход ферментативного превращения по концен­трации сухих веществ в пробах надосадочной жидкости с помощью рефрактометра.

После завершения ферментативной трансформации, реакционную смесь захолаживали до тем­пературы 12-18 "С, не выключая перемешивающее устройство реактора. Комплекс бета-ЦД с цик­логексаном, обладавший сравнительно высокой плотностью около 1,45 г/см³, отделяли от реак­ционной среды, фильтрацией на нутч-фильтре. Вакуум создавали при помощи водокольцевого насоса ВКН-1, соединенного через сборник СБ-1. Осадок комплекса промывали на фильтре водой, собирали, ресуспендирбвали в воде, помещали в реактор и разлагали, при 100 °С, дополнительно продувая содержимое реактора острым водяным паром при помощи врезки «Ф». Циклогексан кон­денсировали с помощью кожухотрубчатого теплообменника Х2, конденсат собирали в сборнике СЦ-1 , отделяли воду, и использовали повторно. В целом, эффективность очистки бета-циклодекст­рина от растворителя зависела от таких факторов, как концентрация суспензии комплекса, коли­чество отогнанной из системы воды, от конструкции аппарата.

Полученный раствор, содержавший бета-ЦД, в горячем состоянии пропускали через нутч- фильтр, собирали в сборнике СБ-1, снабдженном рубашкой обогрева, а затем с помощью насоса Н- 1 подавали в вакуум выпарное устройство ВВ-1, где концентрировали при 60-65 °С. Насыщенный горячий раствор бета-циклодекстрина перемещали в кристаллизатор КР. Образовавшиеся кри­сталлы отделяли на нутч-фильтре, промывали небольшим количеством холодной воды и далее сушили в вакуумной печи ВС-1 до влажности 10-12 %. Вследствие потерь, связанных с несовер­шенством технологического оборудования, выход целевого продукта не превышал 40-45 % от использованного крахмала.

Типичная последовательность технологических операций в технологии бета-циклодекстрина, контролируемой органическими комплексообразователями, также представлена на рис. 15.

Рис. 15. Типичная последовательность операций при получении бета-ЦД методами контролируемой конверсии

7.