Получение циклодекстринов

Получение циклодекстринов методами неконтролируемой конверсии. В промышленном масштабе используется два технологических подхода к получению циклодекстринов: неконтроли­руемый, в ходе которого в биохимический реактор вводится лишь ЦГТаза и раствор крахмала, и контролируемый, когда в реакционную смесь добавляется еще и комплексообразователь — орга­ническое или неорганическое соединение (сольвент), образующее комплекс включения с одним из циклических гомологов, в результате чего возрастает его выход.

Как уже отмечалось, ЦГТазы одновременно катализируют образование не только трех цикло­декстринов, но и осуществляют другие реакции. Производитель обычно нуждается лишь в одном циклическом сахаре, и в основном, это бета-циклодекстрин. Так как механизм трансформации крахмала, ЦГТазой весьма сложен, большинство реакций носит обратимый характер, а цикличе­ские продукты ингибируют ход глубокого превращения субстрата, суммарный выход, например, бета-циклодекстрина оказывается достаточно низким (10—30 %). Последнее обстоятельство сни­жает рентабельность процесса, приводит к проблеме дальнейшей утилизации больших количеств углеводных отходов, для которых должна быть найдена какая-либо сфера применения.

В результате многолетних исследований была выстроена цепь подходов к преодолению много­численных проблем в сложном процессе биотрансформации крахмала в циклодекстрины без использования комплексообразователей. Понимание этих трудностей, является главным для раз­работчиков конкретных процессов.

Тип сырья (крахмала) сильно влияет на конечный выход циклодекстринов, но решение вопро­са о том, какую разновидность субстрата придется использовать, часто может не зависеть от произ­водителя. С наиболее дорогим, но технологически более удобным картофельным крахмалом могут быть достигнуты лучшие результаты по выходу, а в процессе экономических расчетов, окажется, что выгодней и проще использовать доступный и дешевый кукурузный крахмал. Сырье, получен­ное от разных поставщиков, часто имеет в своем составе различные количества амилозы и амило­пектина, что также существенно для выхода циклических продуктов. В России доступен крахмал из ржаного зерна, однако получить с ним высокий выход циклодекстринов довольно сложно. В широком ассортименте имеется кукурузный крахмал, в меньшем — картофельный, но вопрос об их использовании в процессах биосинтеза циклических декстринов следует решать на основе эко­номической и технологической целесообразности.

Концентрации субстрата. Подготовка концентрированных растворов крахмала (клейстера). Более высокий выход циклодекстринов достигается при работе с нативным крахмалом. Однако, в этом случае, достижимое содержание субстрата (крахмала) в биореакторе не может превышать 3-5 %, из-за высокой вязкости клейстера. Снижение концентраций субстрата одновременно при­водит к увеличению объемов биореакторов и повышению капиталовложений. Также возрастают энергетические расходы на выпаривание больших количеств жидкости в процессе последующего выделения бета-циклодекстрина из реакционной смеси, снижаются экономические показатели.

Предобработка ЦГТазами. Практический опыт работы показывает, что ферментативная форма предобработки крахмала более предпочтительна, по сравнению с химической или физической. До­казано, также, что для целей разжижения, вместо альфа-амилазы в процессах производства цик­лодекстринов предпочтительно использовать термостабильные ЦГТазы, хорошо разжижающие крахмал, и лишь незначительно повышающие значения декстрозного эквивалента (ДЭ) концент­рированных крахмальных растворов.

После подготовки субстрата наступает стадия собственно ферментативной трансформации, во время которой в биохимический реактор, представляющий собой автоклавируемую емкость с пе­ремешивающим устройством, вводят ЦГТазу. Уже говорилось о том, что циклизующие ферменты из различных микроорганизмов различаются количественным соотношением образующихся аль­фа, бета и гамма циклодекстринов, накапливающихся в конверсионной смеси после 24-36 ч био­трансформации.

Важным вопросом является, какую дозировку активности следует использовать для органи­зации процесса ферментолиза. К сожалению, назвать конкретные цифры сложно, так как в боль­шинстве публикаций показаны специфические модификации методов определения активности, часто зависящие от природы фермента. Существуют более конкретные рекомендации по подбору концентраций ЦГТазы Paenibacillus macerans, которые могут быть рассчитаны исходя из уравне­ния (Sudzuki, 1975):

Ё= 194/VS,

где Е — величина активности в единицах Тильдон и Хадсон в расчете на грамм кукурузного крахмала, S — его концентрация в реакционной смеси, в массовых процентах. Следует, однако, учитывать, что использовать альфа-специфичную ЦГТазу P.macerans для организации биосинтеза бета-циклодекстрина неэффективно.

Кривая, характеризующая зависимость выхода циклодекстринов от дозировки фермента, име­ет свой оптимум, поэтому подбор оптимальной дозировки следует выполнить экспериментально для каждого конкретного типа ЦГТазы, а также субстрата, предполагаемого к дальнейшему использованию.

Температура биохимической трансформации — еще один фактор, имеющий существенное значение как для подготовки 15-20 % растворов субстрата, так и непосредственно для повышения эффективности биохимической конверсии. Известный принцип использования гидролитических ферментов — чем выше будет температура биохимической реакции, тем активнее и полнее прой­дет процесс, зачастую здесь не подходит.

Рис. 12. Особенности трансформации 15%-ного картофельного крахмала ЦГТазами различной специфичности

ферментативной реакции приводит к изменению соотношения скоростей диспропорционирующей и циклизующей активностей ЦГТаз. Как результат, в конверсионной смеси появляются линейные короткоцепочечные декстрины, ускоряется реакция раскрытия кольца и падает выход цикличе­ских продуктов. В результате может сложиться ситуация, когда более низкие температуры веде­ния процесса получения циклодектринов будут более предпочтительными. Оптимальным темпера­турным режимом для ведения ферментолиза, по всей видимости, можно считать диапазон 50-65 °С. Процесс разжижения следует поводить при 70-75°С, постепенно добавляя в разогретый реактор новые порции крахмальной суспензии содержащей небольшие количества ЦГТазы. Реак­тор должен быть оборудован мощным перемешивающим устройством.

Время трансформации крахмала в циклические декстрины, зависит от температуры, дозиров­ки ЦГТазы и ее специфичности в отношении спектра синтезируемых продуктов. Концентрация циклодекстринов во время конверсии крахмала непрерывно меняется, и содержание циклических олигосахаридов в реакционной смеси практически всегда проходит через максимум. На рис. 12 показаны кривые, характеризующие процесс биохимического превращения крахмала, под дейст­вием типичных ферментных препаратов ЦГТазы из Paenibacillus macerans и Bacillus echimensis и Bacillus sp. (circulans), обладающих различной специфичностью. Как видно из графиков, состав продуктов реакции непрерывно меняется по мере увеличения времени экспозиции реакционной смеси. Из-за превышения времени процесса, ошибок в выборе дозировок фермента, может быть упущен момент, когда концентрация требуемого продукта достигает своего максимума.

Кислотность среды определяется физико-химическими характеристиками используемой ЦГТазы, а именно ее pH-стабильностью и pH оптимумом.

Микробная контаминация — специфичная проблема, связанная с биосинтезом циклодекстри­нов методами, не предусматривающими использование органических комплексообразователей. Условия проведения реакции катализируемой ЦГТазой — температура, pH, длительность процес­са, а также наличие сахаров в реакционной смеси делают ее весьма подверженной микробной контаминации. Развитие микроорганизмов, в основном бактерий, может происходить даже за ко­роткие промежутки времени (12-15 ч), в результате чего часто наблюдается деградация уже обра­зовавшихся циклодекстринов. Бороться с описываемым явлением трудно, если опираться на тех­нологии, не предусматривающие соблюдение стерильности ведения процесса. С другой стороны, создание асептических условий, приводит к существенному удорожанию готового продукта.

Получение кристаллического продукта из концентрированной конверсионной смеси, исполь­зуется лишь в технологии бета-циклодекстрина. Растворимость этого вещества в ряду трех гомо­логов ЦД наиболее низка, (менее 2 % при 20 °С), сильно зависит от температуры, что с успехом пользуются для непосредственной кристаллизации из реакционной смеси. Предварительно осуще­ствляется инактивация ЦГТазы, путем нагревания полученного раствора до 100-120 °С. Затем жидкость охлаждают, корректируют pH, и добавляют препарат глюкоамилазы (альфа-амилазы).

Рис. 13. Последовательность технологических операций при получении бета-циклодекстрина без использования комплексантов

Дозировку этих ферментов и температуру обработки подбирают таким образом, чтобы достичь полного растворения субстрата не трансформировавшегося в циклодекстрины. После повторной термообработки при 120 °С, образуется маловязкий раствор, пригодный для дальнейшей кристал­лизации после упаривания. Следует сказать, что надобность в обработке амилазами во многом за­висит от состава продуктов конверсии крахмала и, по сути, от характера использовавшейся в процессе ЦГТазы. Иногда стадию дополнительной ферментативной обработки просто упускают.

Почти всегда полученную реакционную смесь подвергают дополнительной очистке активи­рованным углем, с целью удаления пигментов, после чего фильтруют. Если реакционная смесь содержит большое количество солей, то возможна стадия очистки фильтрата в колоннах с ионооб­менными смолами. Полученную жидкость концентрируют в вакуум-выпарных аппаратах при

_0Ийясенном давлении примерно до 60 % сухих веществ в жидкости, и в горячем состоянии напра- дпяотт в кристаллизатор, снабженный рубашкой охлаждения и перемешивающим устройством. В онессе изменения температуры жидкости от 80 °С до 20 °С, растворимость бета-циклодекстрина издает со 180 до 20 г/л жидкости, и при этом образуются обильные кристаллы, размер которых за­висит от режима кристаллизации. Их отделяют на специальных центрифугах и споласкивают не­большим количеством холодной воды. Полученный бета-циклодекстрин может быть подвергнут дополнительной перекристаллизации, однако это снижает выход и удорожает продукт, но, одно­временно, повышает показатели его качества. Сушка кристаллов, может быть выполнена в аппа­ратуре различного типа. При этом следует учитывать, что готовый продукт должен содержать кри­сталлизационную воду, а нарушение режимов сушки может привести к ее потере. В заключении следует отметить, что выход реальный бета-циклодекстрина по отношению к кукурузному крахма­

лу обычно составляет 20-28 %.

Типичная последовательность технологических операций в бессольвентной технологии бета-

циклодекстрина, представлена на рис. 13.

6.