Культивация биомассы и индукция промотора

Для успешной экспрессии очень важно оптимизировать плотность жидкой культуры, при которой добавляется индуктор, концентрацию индуктора и время индукции. Эти параметры подбирают индивидуально для каждой пары: экспрессирующий вектор - бактериальный штамм.

Обычно жидкую биомассу наращивают до плотности OD 0,6­0,7 (X = 600 нм) (фаза экспоненциального роста культуры) и проводят индукцию промотора путем добавления IPTG (концентрации индуктора подбирается в диапазоне 0,1 - 1 мМ). Далее культивирование продолжают от 2 до 14 ч (почасовой отбор образцов биомассы позволит установить оптимальное время культивирования).

Для вектора pQE-30, экспрессирующего ген флуоресцентного белка в штамме XL1 -Blue, индукция промотора не требуется, поскольку, как уже отмечалось, базальный уровень экспрессии промотора Т5 с lac-оператором позволяет белку накапливаться в бактериальной клетке. Более того, дополнительная индукция промотора иногда отрицательно сказывается на выходе рекомбинантного белка. Флуоресцентные белки могут несколько снижать скорость деления клеток. При увеличении уровня экспрессии скорость роста трансформированных клеток замедляется, а клоны со случайными рекомбинациями, приводящими к потере фенотипа, получают селективное преимущество и вытесняют из жидкой культуры клеток- продуцентов.

2.6.2.