Метод лазерной конфокальной флуоресцентной микроскопии

После фиксации печени и подвздошной кишки в 10% формалине на натрий­фосфатном буфере рН 7,4, образцы тканей обезвоживали в серии растворов этилового спирта восходящей концентрации, смесей этилового спирта и ксилола, и в чистом ксилоле, после чего пропитывали парафином и заливали в парафиновые блоки на установке «ЕС 350» (фирмы «Microm», Германия).

последовательной промывки в 2 сменах ксилола, 95%, 80% и 70% этиловом спирте и 2 сменах деионизованной воды. Далее проводили пермеабилизацию ткани на срезе путем обработки протеиназой К (фирмы «Sigma», США) активностью 0,6 ед/мл в 0,2M Tris-HC1 буфере с добавлением 0,05% по массе Твин-20, после чего выполняли окрашивание специфическими флуоресцентными красителями. Применяли следующие виды флуоресцентных меток:

1. DAPI (4',6-диамидино-2-фенилининдол);

2. фаллоидин, конъюгированный с флуорохромом CF568;

3. антитела к клаудину-1 и вторичные антитела, конъюгированные с флуорохромом DyLight™ 488;

4. антитела к CD106 (VCAM-1), конъюгированные с флуорохромом Alexa Fluor® 488;

5. антитела к CD31, меченные Alexa Fluor® 647.

Окрашивание микропрепаратов флуорохромами проводили в водных средах в соответствии с протоколами, рекомендуемыми производителями соответствующих флуоресцентных меток. Окончательно препараты после окрашивания заключали под покровные стёкла в нефлуоресцирующую среду «Mowiol» и оконтуривали маникюрным лаком для предотвращения высыхания.

Окрашенные микропрепараты просматривали на конфокальном флуоресцентном микроскопе «LSM 710» (фирмы «Zeiss», Германия).

Часть микропрепаратов тонкой кишки после монтажа на предметные стёкла окрашивали красителями гематоксилином и эозином по стандартной методике [12]и просматривали в проходящем свете в микроскопе «AxioImager Zl» (производства фирмы «Zeiss», Германия), оборудованном цветной камерой. Исследования проведены под руководством научного сотрудника лаборатории спортивного питания с группой алиментарной патологии ФГБУ «НИИ питания» РАМН Смирновой Т.А.

3.11