1. Светлопольная микроскопия Общие принципы световой микроскопии
При помощи световой микроскопии определяют форму, взаимное расположение, тип строения клеточной стенки (грамположительные или грамотрицательные) и ряд других признаков бактериальной клетки, без выяснения которых невозможна идентификация микроорганизма.
Наиболее часто в ветеринарных диагностических лабораториях для микроскопических исследований используют микроскоп биологический рабочий (МБР-1). Оптическая часть микроскопа состоит из системы объективов, окуляров и осветительного устройства.
Пучок света, отраженный зеркалом, через диафрагму попадает в конденсор, далее в виде конуса света на препарат. Пройдя через препарат, лучи расходятся в виде конуса и попадают в объектив. Преломившись в линзах объектива, лучи на выходе из него дают обратное увеличенное изображение объекта, которое строится на определенном расстоянии от задней линзы объектива, точнее, в фокальной плоскости глазной линзы. Из окуляра лучи попадают в глаз исследователя, и на сетчатке строится мнимое увеличенное изображение объекта.
В характеристику микроскопа включают два таких показателя, как увеличение и разрешающая способность. Обе эти функции меняются независимо друг от друга.
Увеличение — способность давать увеличенное изображение исследуемого объекта.
Разрешение — четкость получаемого изображения, определяется как минимальное расстояние между двумя точками, при котором исследователь еще различает их как две отдельные точки.
Для повышения разрешающей способности микроскопа надо использовать коротковолновый свет, например синий или зеленый (0,55 мкм), а также увеличивать показатель преломления среды, граничащей с линзой, чтобы приблизить его к показателю преломления предметного стекла (n = 1,5) и уменьшить явление рассеивания света, идущего в линзу объектива. С этой целью между фронтальной линзой объектива и предметным стеклом помещают жидкость с показателем преломления больше, чем у воздуха, например воду (n = 1,3), глицерин (n = 1,4), кедровое масло (п = 1,5).
Каждой иммерсионной жидкости должен соответствовать свой объектив. Числовая апертура и увеличение объектива указаны на его оправе, например х90 и апертура 1,25. Кроме того, имеются обозначения соответствующей этому объективу типа иммерсионной жидкости: «ми» - масляная иммерсия и черное кольцо на оправе, «ви» — водяная иммерсия и белое кольцо. Объектив «ви» имеет увеличение х70 и апертуру 1,23. Обычно микроскопы имеют объективы мощностью х8, х40 — слабые, безиммерсионные, и х90, х100 — мощные ахроматические иммерсионные (масляные).
Объективы имеют оптические дефекты за счет прохождения через линзу лучей разной длины, с разным фокусным расстоянием (хроматическая аберрация), кроме того, лучи одной длины при прохождении через разные участки линзы также фокусируются по-разному (сферическая аберрация). По степени коррекции указанных дефектов объективы классифицируют на следующие группы: ахроматические объективы — скорректирована сферическая аберрация для одного цвета; хроматические объективы — удалена сферическая аберрация для двух цветов; апохроматические объективы — устранена сферическая аберрация для двух цветов и хроматическая для трех. За счет освещения объектива монохроматическим светом удается избежать хроматической аберрации
Окуляр содержит две линзы - глазную (верхнюю) и собирательную. Линзы выполняют роль лупы, для рассмотрения изображения объекта, даваемого объективом. Окуляры обеспечивают увеличение в 5, 7, 10, 12, 15, 20 раз. Чем сильнее окуляр, тем меньше фокусное расстояние и, соответственно, короче окуляр. Для устранения хроматической аберрации также используют специальные компенсационные окуляры, которые обозначают буквой «К » или «Comp» и цифрой, которая соответствует его увеличению. Сильные окуляры (х15, х20) имеет смысл использовать только в сочетании с апохроматическими объективами.
Осветительное устройство состоит из зеркала, ирисовой диафрагмы и конденсора.
Конденсор крепится под зеркалом, предназначен для собирания параллельных лучей света от источника освещения, стоит из нескольких линз.
Собранные им лучи сходятся в одной точке – фокусе, находящемся в плоскости препарата. Конденсор имеет ирисовую диафрагму (апертурную) при помощи которой убирают лишние лучи света и регулируют апертуру конденсора. Для масляных иммерсионных объективов необходим конденсор с числовой апертурой 1,3-1,4. При работе с конденсором, который рассчитан на использование параллельных лучей, надо использовать только плоскую сторону зеркала.Общее увеличение, достигаемое микроскопом, равно произведению увеличений объектива и окуляра. Использование более сильного окуляра не улучшает качество изображения, которое дает объектив. Качество изображения можно несколько улучшить за счет правильной установки конденсора и осветителя. Уменьшение раскрытия диафрагмы приводит к уменьшению угла падения света на объектив и, как следствие, к уменьшению рабочего значения числовой апертуры, что, в свою очередь, при прежнем увеличении уменьшит разрешение. При работе лучше использовать достаточно мощный объектив при малом окуляре, а не наоборот, так как при равном суммарном увеличении использование сильного окуляра приводит к уменьшению света, идущего а глаз, что способствует снижению остроты зрения исследователя. Числовая апертура объектива и конденсора по возможности должны быть идентичны. Яркость поля зрения нецелесообразно регулировать за счет положения конденсора или ирисовой диафрагмы конденсора и осветителя, лучше этого достичь изменением накала нити лампы. В микробиологии максимальное разрешение (0,2 мкм) достигается с объективом числовой апертуры 1,3-1,4 и масляной иммерсией. При объективе с большой апертурой (1,4) и масляной иммерсией необходимо ввести иммерсионную жидкость между конденсором и нижней поверхностью предметного стекла, а не только между стеклом и линзой объектива. Существенно, чтобы предметное стекло было тонким, иначе расстояние между конденсором и объектом будет больше фокуса. Таким образом, если исследователь желает детально видеть бактериальные клетки, исследуемый препарат должен быть практически частью однородной оптической системы и залит маслом, водой или другой средой.