4 Люминесцентная микроскопия

В основе люминесцентной микроскопии лежит способность микроскопических структур изучаемого объекта флюоресцировать при облучении препарата коротковолновыми лучами. Возбуждающий свет преобразуется флюоресцирующими участками препарата в свет люминесценции.

Свет люминесценции характеризуется большей длиной волны, чем свет возбуждения. В результате этого флюоресцирующие структуры и участки микроскопического препарата становятся видимыми.

Люминесценция исследуемых препаратов может возбуждаться ультрафиолетовыми лучами ближнего спектра (с максимумом излучения 365-366) или сине-фиолетовыми лучами видимого спектра (с максимумом излучения 400-420), которые имеют меньшую длину волны, нежели другие видимые лучи (зеленые, желтые, оранжевые, красные). В соответствии с этим различают люминесцентную микроскопию в ближних ультрафиолетовых лучах и люминесцентную микроскопию в видимом свете.

В качестве источников возбуждающего света применяются преимущественно ртутно-кварцевые лампы сверхвысокого давления и дуговые лампы, характеризующихся большой яркостью свечения. Светофильтры возбуждающего света нередко пропускают красные и инфракрасные лучи. Для устранения этих лучей на пути светового пучка между источником света и светофильтрами возбуждения помещают кювету, наполненную дистиллированной водой, или специальные стеклянные теплозащитные фильтры.

В зависимости от выбранного набора светофильтров в микроскоп поступают только лучи с определенным интервалом длин волн. Для устранения возбуждающего света из поля зрения микроскопа между объектом исследования и глазом наблюдателя помещают защитные (запирающие) светофильтры. Для поглощения ультрафиолетовых, фиолетовых и синих лучей применяют фильтры желтого цвета. При этом используется принцип скрещенных светофильтров. Этот принцип заключается в наиболее эффективном сочетании двух светофильтров, из которых первый пропускает лучи от источника только той части спектра, которая необходима для возбуждения флюоресценции; второй светофильтр, через который наблюдается флюоресценция объекта, должен полностью поглощать первичный возбуждающий свет, свободно пропуская весь свет флюоресценции исследуемого объекта.

При использовании иммерсионных объективов применяют специальное нефлюоресцирующее иммерсионное масло, допускается применение диметилфталата.

Большинство клеток микроорганизмов обладает весьма слабой собственной или первичной люминесценцией. Так могут флуоресцировать некоторые бактерии из группы Pseudomonas, некоторые пигменты (хлорофилл), алкалоиды, некоторые антибиотики и другие вещества биологического происхождения.

В тех случаях, когда объект не обладает явлением люминесценции, прибегают к обработке его специальными красителями - флюорохромами, флюоресцирующими соединениями, имеющими функциональные группы, с помощью которых происходит прочная химическая связь с белком. Такими группировками могут быть изоцианатная, тиоизоцианатная, сульфохлоридная. В соответствии с этим для присоединения к иммунным белкам применяются изоцианаты, изотиоцианаты и сульфохлориды некоторых флюоресцирующих красителей. В результате присоединения несколько изменяется конфигурация молекул белка, интенсивность свечения уменьшается в 2-3 раза, но остается достаточно высокой при просмотре в люминесцентном микроскопе, особенно, если на одну молекулу белка включено незначительное число радикалов красителя.

Флуорохромы могут окрашивать не только всю микробную клетку, но и избирательно концентрироваться на определенных клеточных структурах, вызывая их свечение. Благодаря малой токсичности применяемых растворов красок создается возможность изучать живую неповрежденную клетку. В ряде случаев наведенная флуоресценция позволяет отмечать изменения клеточных структур при различных функциональных состояниях клетки (прижизненное флюорохромирование). Кроме того, этот метод очень удобен для выявления живых и мертвых клеток, которые по-разному адсорбируют флюорохромы.