Изучение организации эндотелия аорты человека in situ

1.1. X имические реактивы

Глутаровый альдегид гистологической чистоты, 25 % водный раствор, желатина - Sigma, Polysciences, Serva (США); какодилат натрия, натрия гидроокись, нитрат серебра, одно- и двузамещенный фосфат натрия - Merck (Германия); среда 199 и раствор Эрла - НИИ Полиомиелита (Россия); глицерин - Реахим (Россия); фотографический проявитель и нейтральный фиксаж готовили по рецептуре D19 и D105 (Kodak) из реактивов отечественного производства (Реахим).

1.2. Аутопсийный материал

Материалом для исследования служили грудные отделы аорт и легочные артерии, полученные при проведении срочных (1-5 часов с момента констатации смерти) патолого-анатомических вскрытий лиц, погибших в результате различных причин в возрасте от 1 до 70 лет. Забор материала проводился в судебно- медицинском морге НИИ Скорой помощи им. Н.В.Склифосовского, 2-м и 4-м моргах ГУЗМ РФ.

1.3. Импрегнация межклеточных контактов

После извлечения из трупа аорту освобождали от соединительной ткани и отмывали от крови средой 199. Сосуд разрезали вдоль, отступив 0.5 см от устьев межреберных артерий, переносили на парафиновую "платформу" и закрепляли по периметру булавками. Парафиновая платформа представляла собой лоток размерами 25x15x3 см (длина/ширина/высота), дно которого было залито слоем парафина толщиной около 1 см. После дополнительной отмывки средой 199 сосуд фиксировали в течение 10 минут 2,5 % раствором глутаральдегида (ГА) на 0.1 М какодилатном буфере pH 7.2-7.4. Одновременно, оценивали степень и локализацию атеросклеротических поражений (см. ниже). Окрашивание межклеточных контактов проводили 0.1 % водным раствором нитрата серебра. Избыток красителя удаляли быстрой промывкой дистиллированной водой, после чего препарат заливали раствором ГА еще на 15-30 минут. Для визуализации "серебряных линий" применяли фотографическую обработку: препарат обрабатывали фотографическим проявителем (1-2 минуты), отмывали проточной водой и фиксировали в нейтральном фиксаже (5-10 минут).

Затем препарат сосуда снимали с платформы и отделяли адвентицию с остатками соединительной ткани. Для приготовления постоянного гистологического препарата целый сосуд или его отдельные фрагменты монтировали эндотелием вниз на стеклянную пластинку подходящего размера (отмытую от слоя эмульсии фотографическую пластинку размером 6x9 или 15x18 см), заключали в глицерин- желатину, накрывали полиэтиленовой пленкой и помещали под груз до полного застывания заливочной среды. Полученные препараты хранили при +4°С (без видимой потери качества изображения до 10-15 лет).

Аналогичным образом получали препараты фрагментов других сосудов: легочной и бедренной артерии, верхней и нижней полой вен и др.

Для устранения возможных артефактов фиксации, связанных с ретракцией сосудов после извлечения, часть аорт была зафиксирована "под физиологическим давлением" путем интракорпоральной перфузии. Для этого, после вскрытия грудной и брюшной полостей восходящую часть аорты и подвздошные артерии канюлировали; на отходящие артериальные стволы накладывали лигатуры или зажимы. Промывку, первую фиксацию, окрашивание, отмывку от нитрата серебра и последующую 15-минутную фиксацию проводили методом перфузии под давлением около 100-120 мм рт.ст. Дальнейшую обработку проводили после извлечение сосудов из трупа с использованием парафиновой платформы, как описано выше.

Сравнительный анализ эндотелия на препаратах, приготовленных описанными способами, не выявил принципиальных различий в организации эндотелиального пласта, поэтому, в дальнейшем основная часть препаратов была приготовлена по первому методу.

Использование раннего аутопсийного материала (1-3 часа с момента констатации смерти) и щадящих методов фиксации позволило заметно снизить количество механически деэндотелизованных участков и избежать артефактов, связанных с приготовлением пленочных препаратов эндотелия. Кроме этого, применение для визуализации изображения фотографической обработки позволило сократить практически вдвое время изготовления препаратов и получить высокий контраст межклеточных контактов.

- возможность точной локализации и ориентации исследуемого участка;

* применение световой микроскопии в проходящем свете (через все слои сосудистой стенки;

. отсутствие ретракции, связанной с высушиванием препарата (необходимый этап приготовления препаратов для СЭМ);

- возможность исследования обширных полей эндотелиальной выстилки на всем протяжении сосуда независимо от степени поражения и рельефа;

- анализ динамики изменения характера организации эндотелия в местах атеросклеротических поражений (например, при переходе от визуально "нормальных" участков через склоны и центр атеросклеротической бляшки или вокруг нее);

- быстрота фотографирования и изготовления иллюстративного материала, в том числе, для последующего морфометрического анализа.

1.4. Выбор зоны исследования

В визуально "нормальных” сосудах детей и взрослых лиц организацию эндотелиального монослоя исследовали раздельно в зонах с высокой и низкой предрасположенностью к атеросклерозу (зоны ВПА и НПА, соответственно) на протяжении всего грудного отдела аорты, но не ближе, чем в 0.2 - 0.5 см (в зависимости от размеров сосуда) от устьев межреберных артерий. Схема расположения исследуемых участков представлена на рисунке 1.

межреберные артерии

—------------------------------- 7

Рисунок 1.

Расположение участков, соответствующих зонам с низкой (НПА) и высокой (ВПА) предрасположенностью к атеросклерозу, использованных при анализе организации эндотелия in situ.

В атеросклеротических аортах, помимо перечисленных визуально неизмененных участков, эндотелий анализировали над центром (фиброзной покрышкой), склонами и по периферии атеросклеротических бляшек, а также между близко расположенными бляшками.

1.5. Морфометрия и построение гистограмм

Измерение площади и индекса формы ЭК проводили по фотографиям (увеличение 300-600Х) эндотелия с перечисленных зон на полуавтоматическом анализаторе изображения (MOP-3, Leytz A.S.M., Image analysis system). Для

построения гистограмм измеряли не менее 500-1000 клеток в каждом из 3-6 случайно выбранных полях зрения микроскопа.

В основу деления ЭК на классы (по размеру) был положен метод, предложенный ранее [Долгов и др., 1983; Репин и др., 1983]: к "мелким" были отнесены клетки, имеющие площадь менее 400 мкм², "средние", "крупные" и "гигантские" клетки имели размеры в диапазоне 400-800, 800-1200 и более 1200 мкм², соответственно. При этом, несмотря на то, что предложенное деление клеток на классы было условным, в целом оно было принято. Как показали результаты морфометрии, 95-98 % ЭК детских аорт укладывается в категорию "мелких и средних": их размеры не превышают 780-820 мкм². В дальнейшем, эти две популяции были объединены в одну группу "мелких и средних"; по аналогии, клетки с площадью более 1200 мкм² объединили в популяцию "крупных и гигантских".

2.