Культура клеток

2.1. Культуральные среды, реагенты и пластик

Среда 199 с солями Эрла, среда RPMI-1640, эмбриональная телячья сыворотка или сыворотка, полученная от новорожденных телят, сбалансированный солевой раствор Эрла, L-глутамин, пируват натрия, пенициллин-стрептомицин, бикарбонат натрия, трипсин-ЭДТА, HEPES - от фирм GIBCO или ICN (США).

Чашки Петри (35, 60, 100 мм), 6, 12, 24, 48-камерные культуральные пластины (мультивеллы), проницаемые культуральные системы TransWell, покровные стекла, центрифужные пробирки, пипетки и другие расходные материалы для культивирования клеток - Coming или Costar (США, Голландия).

2.2. Первичная культура эндотелия аорты человека

Сосуды, изолированные в асептических условиях через 1-4 часа после наступления смерти, освобождали от соединительной ткани и адвентиции. После отмывки от крови средой 199 или раствором Эрла аорту вскрывали вдоль и оценивали степень атеросклеротического поражения. Атеросклеротические бляшки, содержащие некротическое ядро или изъязвление поверхности, иссекали.

Выделение ЭК проводили со всей поверхности аорты или раздельно из зон НПА и ВПА. Для этого аорту разрезали вдоль на два фрагмента приблизительно одинаковой площади (Рис. 2), каждый из которых инкубировали при +37°С в растворе фермента, приготовленного на среде 199 с добавлением антибиотиков. Выбор фермента (0.1 % коллагеназа или 0.15 % диспаза) и продолжительности ферментативной обработки был проведен в серии предварительных экспериментов.

о о _ОВПА_О

Рисунок 2.

НПА

Схема расположения зон с высокой (ВПА) и низкой (НПА) предрасположенностью к атеросклерозу, использованная для селективного выделения ЭК.

Результаты одного из них

приведены на рисунке 3. Видно, что число

снимаемых коллагеназой клеток прогрессивно возрастает на протяжении всего времени инкубации. При этом открепление ЭК происходит преимущественно на 25- 35 минуте; к этому времени удается снять не более 50-60 % эндотелия. Дальнейший выход сопровождается массивной контаминацией ГМК из более глубоких слоев интимы. В результате, к моменту снятия всех ЭК суспензии содержат до 50-60 % ГМК, что делает такие культуры абсолютно непригодными для дальнейшего использования. Короткие времена инкубации в коллагеназе, хотя и позволяют получить чистую культуру ЭК, лишают ее репрезентативности, поскольку дают возможность изолировать лишь половину клеток. Этих, негативных, свойств практически лишена диспаза*. нарастание числа снимаемых клеток наблюдается лишь до 45-60 минут инкубации, в дальнейшем выходит на плато и на протяжении последующих 1-2 часов практически не меняется. Полученные в результате часовой инкубации суспензии состоят на 95-98 % из ЭК и обладают высокой жизнеспособностью (эффективность прикрепления до 98 %).

О 30 60 90

ВРЕМЯ ИНКУБАЦИИ, мин

Рисунок 3.

Сравнение числа клеток, снимаемых с единицы луминальной поверхности аорты коллагеназой или диспаэой.

Таким образом, диспаза обладает очевидным преимуществом. Низкая контаминация получаемых первичных культур гладкомышечными клетками, нетребовательность к продолжительности ферментативной обработки и возможность снятия с поверхности сосуда практически всех ЭК делают этот фермент незаменимым для получения чистых высоко репрезентативных культур эндотелия. С учетом полученных результатов, все последующие выделения проводились с применением 0,15 % диспазы; время инкубации составляло около 60 минут.

В последующем, методика инкубации была несколько видоизменена. Сосуды выдерживали в 0.15 % растворе фермента на среде 199 в течение ночи при +4°С, затем инкубировали при +37°С на протяжении 30-40 минут.

По окончании инкубации, аорту дополнительно промывали раствором Эрла, обе суспензии клеток объединяли и центрифугировали 10 минут при 600-1000 g. Осадок ресуспендировали и высевали на предварительно покрытые 0,1 % желатиной чашки Петри в среде культивирования следующего состава: среда 199 с солями Эрла с добавлением 25 мМ HEPES, 100 Ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 10 % сыворотки, 5 Ед./мл гепарина и 50 мкг/мл фактора роста ECGF. Культуры помещали в СОг-инкубатор и выращивали при +37°С и 5 % СОг- Через 18-24 часа культуры отмывали раствором Эрла и заменяли среду культивирования на свежую. Дальнейшие смены среды проводили через 48 часов.

Аналогичным образом получали первичные культуры эндотелия легочной артерии человека.

2.3. Эндотелий пупочной вены человека

Материалом для выделения клеток служили пупочные канатики, полученные во время нормальных своевременных родов. Для получения первичных культур ЭК пупочной вены человека использовали метод Gimbrone et al. [1974] в модификации Антонова и соавт. [1981]. Как и в случае выделения эндотелия аорты, вместо коллагеназы использовали 0.15 % раствор диспазы. Время инкубации с ферментом составляло 30-45 минут. Последующие этапы выделения и условия культивирования были аналогичны описанным для эндотелия аорты.

2.4. Гладкомышечные клетки

Материалом для выделения ГМК служили фрагменты "нормальных" аорт лиц преимущественно молодого возраста, остающиеся после выделения эндотелия. Фрагменты интенсивно отмывали раствором Эрла для удаления оставшихся ЭК и помешали в 0.2 % коллагеназу, приготовленную на полной среде 199. После инкубации в течение 2-3 часов при +37°С раствор фермента сливали, фрагмент заливали раствором Эрла и энергично встряхивали (вручную или на встряхивателе типа Vortex).

После достижения клетками состояния конфлуэнтности культуры отмывали раствором Эрла и снимали трипсином-ЭДТА. Часть клеток ресуспендировали в сыворотке с добавлением 10 % DMSO и в концентрации около 10⁶ клеток/мл замораживали в жидком азоте для длительного хранения и последующего применения; другую - ресуспендировали в среде культивирования и использовали для посадки под конкретные эксперименты.

В случае использования предварительно замороженных ГМК, клетки оттаивали, отмывали центрифугированием в среде культивирования и высевали на чашки. В дальнейшем с ними поступали, так же как и с первичными культурами.

2.5. Лейкоциты и линейные клетки

Лейкоциты выделяли из гепаринизированной крови методом центрифугирования в градиенте плотности фиколла (1.077 г/л) или с использованием готовой коммерческой среды LymphoPrep или LymphoSep (ICN). Полученные суспензии отмывали центрифугированием и ресуспендировали в среде RPMI-1640 со всеми необходимыми добавками и 10 % инактивированной нагреванием сыворотки.

В ряде экспериментов использовали клеточную линию про-миелоцитов человека - HL-60, любезно предоставленную д-ром G.A.Zimmerman (Cardiovascular Research and Training Institute, University of Utah, Utah, U.S.A.).

аналогичного состава и пересевали путем разведения 1:5 при достижении ими концентрации порядка 5-Ю⁶ клеток/мл. Основные характеристики клеток линии HL- 60 описаны в литературе [Mansfield, Suchard, 1993].

2.6. Совместное культивирование ЭК и ГМК

При изучении перекрестных влияний ЭК и ГМК использовали три разновидности способов со-культивирования с применением:

I - кондиционированных сред; 2 — системы со-культивирования иа покровных стеклах; 3 - проницаемых культуральных вкладышей TransWell.

В первом случае, ГМК, достигшие плотности субконфлуэнтного монослоя, культивировали в свежей порции среды в течение 24 часов. Полученную кондиционированную среду центрифугировали и сразу (без хранения в замороженном состоянии) использовали для добавления к культивируемым ЭК.

Во втором, - за 5-7 суток до начала эксперимента ЭК и ГМК пассировали и выращивали раздельно в ячейках 12-камерных планшетов и на круглых покровных стеклах подходящего размера, соответственно. После замены среды на свежую в ячейки помещали тефлоновые кольца-прокладки толщиной 2 мм, на которые накладывали (клетками вниз) покровные стекла, содержащие другой клеточный тип. Избыток культуральной среды отсасывали. Конечный объем среды в системе составлял 0.7 мл. Необходимые компоненты (например, [³Н]-тимидин) добавляли непосредственно под покровное стекло. По истечении необходимого времени со- культивирования систему разбирали; один или оба типа клеток использовали для последующего анализа.

В последнем случае система дтя со-культивирования состояла из клеток одного вида, растущих на дне культуральных ячеек; другого вида - на культуральных вкладышах TransWell соответствующего диаметра. Как и в предыдущем случае, ЭК и ГМК культивировали раздельно, а сборка системы проводилась после замены среды в обеих культурах. В случае использования 24- камерных культуральных планшетов объем среды культивирования в системе составлял 1 мл.

2.7. Импрегнация границ ЭК в культуре

Конфлуэнтные монослои отмывали от среды культивирования раствором Эрла и фиксировали в течение 10 минут 2,5 % раствором глутарового альдегида на фосфатном буфере Дульбекко. Окрашивание культур нитратом серебра и визуализацию "серебряных линий" проводили так же, как и в случае эндотелия in

situ, сократив время второй фиксации до 15-30 минут. Полученные препараты докрашивали гематоксилином и заключали под покровное стекло в глицерин- желатину.

3.