Методы определения маркеров синдрома смешанного антагонистического ответа

Определение содержания про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови.

Цитокиновый профилъ, TNFa, IL-Ιβ, IL-4, IL-6, IL-10 (пг/мл, ОП 450 нм)

Анализируемые образцы инкубируют в лунках стрипированного планшета с иммобилизованными моноклональными антителами к TNFa, IL-Ιβ, IL-4, IL-6, IL-10.

Определение содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови.

Иммуноглобулины A, G, M, Ig A, G, M (мг/мл, ОП 450 нм)

Анализируемые образцы инкубируют в лунках стрипированного планшета с иммобилизованными моноклональными антителами к Ig A, G, M. Затем планшет отмывают. На второй стадии связавшиеся в лунках цитокины обрабатывают конъюгатом моноклональных антител с HRP. После отмывания избытка конъюгата образовавшиеся иммунные комплексы выявляют ферментативной реакцией HRP с перекисью водорода в присутствии хромогена (ТМБ). Интенсивность окраски хромогена пропорциональна концентрации цитокинов в анализируемом образце. Результаты учитывают фотометрически после остановки пероксидазной реакции стоп-реагентом. Концентрации цитокинов в образцах определяют по калибровочному графику.

Определение содержания маркеров оксидативного стресса и антиоксидантной системы.

Малоновый диальдегид, МДА (мкмолъ/л, ОП 530 нм)

К 0,1 мл крови прибавляют 2 мл дистиллированной воды, инкубируют в течение 2 часов для гемoлиза.

Супероксиддисмутаза Cu/Zn, Cu/ZnSOD (нг/мл, ОП 450 нм)

Образцы сыворотки разбавляют рабочим раствором РBS 1:20. Ячейки планшета промывают дважды промывочным раствором. Добавляют по 100 мкл РBS в ячейки, предназначенные для стандартов, оставив первые ячейки пустыми. Затем готовят стандартные разведения дoбавлением 200 мкл стандарта Cu/ZnSOD в ячейки А1 и А2 и создают разведения стандартов Cu/ZnSOD в диапазоне от 5 до 0,8 нг/мл переносом по 100 мкл жид^сти из ячейки в ячейку. Удаляют 100 мкл жидкости из последних ячеек (G1, G2). Вшсят по 100 мкл РBS в ячейки «Бланк». Затем вносят по 90 мкл РBS в ячейки, предназначенные для образцов. Вносят по 10 мкл каждого предварительно разбавленного в 1:20 образца в соответствующие ячейки. Дoбавляют по 50 мкл разбавленного пероксидазного конъюгата во все ячейки, включая «Бланк». Затем инкубируют 1 час при температуре 18-25°С. После этого полшстью удаляют содержимое ячеек и промывают ячейки 3 раза промывочным буфером. Вносят по 100 мкл субстратного раствора во все ячейки, включая «Бланк». После инкубирования при комнатной температуре в течение 10 минут дoбавляют по 100 мкл стоп-раствора во все ячейки, включая «Бланк». Затем определяют ОП ячеек против «Бланка». Рассчитывают среднее значение поглощения для каждого стандарта и образца. Строят калибровочную кривую и определяют концентрацию Cu/Zn SOD в образцах из стандартной кривой.

Церулоплазмин, ЦП (мг/дл, ОП 340 нм)

Определяют с помощью биохимического анализатора в ходе турбидиметрической реакции между поликлональной анти-ЦП сывороткой и ее соответствующим антигеном в присутствии шлиэтиленгликоля. ОП

образовавшегося иммунного комплекса пропорциональна содержанию ЦП в образцах.

Определение содержания маркеров нарушений системы гемостаза в сыворотке/плазме крови.

Система гемостаза: активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) (сек.), протромбиновое время (ПВ) (сек.), Фг (г/л), антитромбин-Ш (АТ-III) (%)

Все параметры системы гемостаза определяют с помощью полуавтоматического коагулoметрического анализатора.

Определение содержания маркеров наличия и тяжести инфекционного процесса в сыворотке крови.

СРБ (мг/л)

Определение содержания СРБ осуществляют с помощью турбидиметрического метода с латексным реагентом, содержащим латексные частички, покрытые специфическими антителами к человеческому СРБ, которые дают агглютинацию при смешивании с пробами, содержащими СРБ. Агглютинация вызывает изменение абсорбции, зависящей от содержания СРБ в пробе. Результат определяют в сравнении с калибратором с известной концентрацией.

Прокальцитонин (РСТ), (нг/мл)

Используют иммунохроматографический тест для полуколичественного определения РСТ. Сыворотку наносят на тестовую систему. Трейсер связывается с РСТ в oбразце с последующим образованием комплекса антигенантитело. Эти комплексы шд воздействием капиллярной силы

распространяются по тестовой системе и в зoне «тестовой полоски»

взаимодействуют с антикальцитониновыми антителами, в результате чего образуется «сэндвич»-комплекс. При концентрации РСТ>0,5 нг/мл «сэндвич»- комплекс проявляется в виде полосы красшго цвета, интенсивность окраски которой зависит от содержания РСТ в образце.

Антитела к Core-региону эндотоксина, IgG EndoCab (GMU/мл, ОП 450 нм)

Эндотоксины, в комплексе с полимиксином B составляют антиген, сорбированный на твердой фазе. Во время первой инкубации антитела к core- региону эндотоксина захватываются и связываются с твердой фазой. Не связавшийся материал, присутствующий в пробе, удаляют во время отмывки. Далее в ячейки вносят конъюгированные с пероксидазой антитела (трейсер) к Ig(G) человека. Если в пробе присутствуют антитела EndoCab, то трейсер связывается с захваченными антителами EndoCab. Избыток трейсера затем удаляют отмывкой и в лунки вносят субстрат ТМБ. Окраска развивается пропорционально концентрации антител к core-региону эндотоксина. Реакцию останавливают добавлением кислоты, и абсорбцию измеряют фотометрически.

5.2.